实验四同工酶预案.ppt

* 实验四 过氧化物同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分析 * （1）掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）技术的原理和操作方法。 （2）掌握PAGE法分离过氧化物同工酶的原理和方法。 一、实验目的 二、实验原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 过氧化物同工酶及活性染色 二、实验原理 1、电泳概念：带电粒子在电场中向与其电性相反的电极移动的现象。 ○ ○ ○ ○ — + + - + - 二、实验原理 2、电泳分类： 显微电泳 自由界面电泳 区带电泳 纸电泳 醋酸薄膜电泳 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 二、实验原理 3、电泳法原理：在一定条件下，任何带点颗粒都有自己特定的电泳迁移率。影响电泳迁移率的因素： 颗粒性质：净电荷数目、颗粒大小、颗粒形状 电场强度：V/cm 溶液性质：缓冲液的pH、离子强度、溶液黏度、电渗 二、实验原理 4、聚丙烯酰胺凝胶电泳：是由单体丙烯酰胺（Acr）和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在加速剂 N,N,N,N-四甲基乙二胺（TEMED）和催化剂过硫酸铵（AP）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE) * 反应过程： TEMED催化AP生成硫酸自由基 S2O82－ 2SO4·ˉ 硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体长链： * Bis将单体长链间连成网状结构： * PAGE法分离蛋白质的三种效应： 电荷效应：各种蛋白质分子所带电荷不同，在同一电场中泳动率不同； 分子筛效应：蛋白质分子大小和形状各不相同，在通过一定浓度（一定孔径）凝胶时受阻力各不相同，泳动率也不相同； 浓缩效应：凝胶为不连续系统（凝胶层、pH、电位梯度均不连续），从而使样品浓缩在一个极窄的起始区带，即所谓浓缩效应，提高了条带分辩率。（只有不连续凝胶具有此效应） * 二、实验原理 过氧化物同工酶及活性染色 （1）同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构及其理化性质不同的一组酶。同功酶是机体调节酶活性的一种方式，在各种生物体中广泛存在。 （2）过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。因此，测定这种酶的活性或其同工酶的变化情况，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。 二、实验原理 过氧化物同工酶及活性染色 （3）本实验采用PAGE技术，分离植物幼苗过氧化物酶同工酶，根据酶的生物化学反应，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。 过氧化物+过氧化物酶 → 复合物 复合物+DH2 → 过氧化物酶+H2O+D 双氧水 联苯胺 棕色物质 * 三、仪器和试剂 1、仪器： 高速离心机、垂直电泳槽、电泳仪。 2、试剂： 样品提取液、上样缓冲液（0.5%溴酚蓝+40%蔗糖）、凝胶贮液N液、分离胶缓冲液L液、10%过硫酸铵、TEMED、1×电极缓冲液、同工酶显色液。 * 四、实验步骤 凝胶制备： 聚丙烯酰胺凝胶配方 成分 含量 作用 N液（29.2%Acr-0.8%Bis） 5mL 交联剂 L液（Tris） 5mL 缓冲液 蒸馏水 10mL TEMED 20μL 加速剂 4℃储存，用量可适量调整 10% AP 100μL 催化剂 现用现配，用量可适量调整 * 四、实验步骤 样品制备： 称取0.5g植物幼苗，放入研钵内，加入1mL样品提取液（pH8.0），于冰浴中研成匀浆，全部转入1.5mL离心管中，10000r/min离心10min，吸取100μL上清液至新离心管中，加入等量的上样缓冲液，混匀，即为样品液。 * 四、实验步骤 装槽、上样： 30μL左右 * 四、实验步骤 电泳： 接好电源线（上槽接负极，下槽接正极）。打开电源开关，调节电压，以10V/cm稳定电压电泳，待前沿指示染料溴酚蓝下行至距胶板末端1-2 cm处，即可停止电泳。 * 四、实验步骤 剥胶、染色： 电泳结束