王镜岩生物化学经典蛋白质合成和基因工程研究报告.ppt

(一) DNA限制酶与连接酶 类型Ⅰ限制酶为多亚基双功能酶，S亚基为识别亚基，识别位点为两部分序列，中间有一定长度的任意碱基对，M亚基有甲基化酶活性，R亚基为切割亚基，可在识别位点1kb以上处随机切割。 类型Ⅱ限制酶有两个相同的亚基组成，识别位点为4~6bp的回文序列，切割位点在识别位点内，或靠近识别位点，经切割可以生成平头末端或粘性末端，可以产生相同粘性末端的不同的限制酶称作同尾酶。类型Ⅱ限制酶是分子生物学中最重要的工具酶。 类型Ⅲ限制酶为两个亚基的双功能酶，M亚基为识别亚基， R亚基为切割亚基，切割位点在识别位点下游24~26bp处，特异性不强。 EcoRI与DNA的复合体 限制性内切酶切割DNA形成对应的粘性末端 外源DNA可以被插入质粒载体 接头用于建立克隆片断的末端 使用相同的粘性末端进行重组，会有较多的载体自身环化，或目的基因串联，目的基因的定向连接常使用两种限制酶，产生两种不同的粘性末端。 可以在载体和目的基因的两端连接接头（引入限制酶切点），或衔接物（含有粘性末端），再连接载体和目的基因。 T4连接酶催化的反应 大肠杆菌的连接酶只能连接粘性末端，T4连接酶可以连接平头末端，其条件是：提高T4连接酶的浓度；提高DNA片段的浓度；降低ATP浓度；加入多胺类如亚精胺；加入浓缩剂如乙二醇。 (二) 分子克隆的载体与宿主系