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目 录 PCR的概念 PCR技术的创建 PCR的原理 PCR的反应体系和方法 PCR的常见问题 PCR的类型和应用 PCR技术的概念 多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称ＰＣＲ技术，是８０年代中期发展起来的一种体外扩增特异ＤＮＡ片段的技术。此法操作简便，用一对寡聚DNA作为引物，通过加温变性－退火－DNA合成这一周期的多次循环，可在短时间内在试管中获得数百万个特异的目的ＤＮＡ序列的拷贝。由于这种扩增产物是以指数形式积累的，经25－30个循环后，扩增倍数可达106。 （2) 序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。 （3）碱基尽可能随机分布，G+C占40-60%，过高或过低都不利于引发反应。 （4）引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。 二. PCR方法步骤 １．向无菌的200μl Eppendorf管中依次加入以下溶液。 Buffer，dNTP，MgCl2，无菌水，Taq酶，引物，模板。 经典循环参数（1000bp以内） PCR常见问题 一.没有扩增产物 a．需检查一下Taq DNA聚合酶是否失活，或是活性太低，还需查一下在加样过程中是否向体系中加过Taq DNA聚合酶； b．需检查一下所使用的引物，看其序列设计是否正确，是否碱基组成不平衡； c．需要检查一下PCR反应过程中模板是否变性充分，尤其在前几个循环中是否变性充分；可以适当地提高模板变性的温度或是适当延长变性的时间； d．需检查一下在PCR反应体系中是否有Taq DNA聚合酶的抑制剂，如SDS污染、蛋白酶、核酸酶、其它抑制聚合酶活性的成份等等； e．需检查一下模板中是否有蛋白酶和核酸酶的污染，可以预先加热使之失活。 PCR常见问题 二.电泳检测PCR产物呈涂布状 a．需检查一下Taq DNA聚合酶的用量，适当地减少Taq酶的量有助于特异性条带扩增；调整引物和模板的用量； b．可以提高反应的退火温度，或者直接采用两个温度的PCR（68℃退火和延伸，94℃模板变性）； c．适当地降低Mg2+ 的浓度也可起到降低非特异性扩增可能性的作用； d．适当地减少反应退火的时间和延伸的时间； e．适当地减少循环次数也会有效果； f．可以尝试使用巢式PCR（nested primer PCR）。 PCR常见问题 三.电泳检测PCR产物出现非特异性条带 a．需检查一下引物的3’端是否有连续排列的G或C； b．可以适当地提高退火温度或直接采用两步温度PCR方法进行扩增； c．可以降低Taq DNA聚合酶的用量，同时也降低引物的浓度； d．可以适当地减少退火所用的时间以及延伸反应的时间； e．可以适当地增加或减少一些Mg2+浓度。 PCR常见问题 四.引物二聚体的形成 a．需检查一下是否严格冰上操作(非热启动酶)； b．需检查一下两个引物的3’端是否互补，或者是否有相类似的回文结构； c．需检查一下使用的引物是否太短，可以予以适当的延长； d．需检查模板的用量，模板太少会造成引物相对过量； e．适当地降低引物的浓度，引物浓度过高是出现引物二聚体的最主要原因； f．循环次数太多也易形成引物二聚体，可以适当地减少循环数； g．可以将退火温度提高一些以减少引物二聚体形成。 h．使用热启动酶克服。 PCR常见问题 五.假阳性结果 a．实验器材应一次性使用(枪头、PCR管) b．注意操作环境，戴一次性手套 c．严格PCR操作规程 d．多次取样的试剂应分装 e．设置阴性对照和阳性对照 交叉污染的处理方法包括： （1）在DNA模板和多聚酶加入前，紫外线照射反应管内容物以破坏污染的PCR产物。一般选用波长254nm照射30min（Nature, 1990, 34:27）。 （2）使用dUTP扩增，在扩增前使用尿嘧啶糖基化酶处理可降解交叉污染的PCR产物，而不降解基因组DNA模板，然后热灭活此酶，再进行扩增反应（Gene, 1990, 93: 125）。美国PE公司提供此类试剂盒（PCR carry-over preventionkit）。 （3）在PCR反应前加入一种光化学试剂，反应完成后激活该试剂，光化学试剂可交联DNA链，使之不能再扩增（Nucleic Acids Res, 1991, 19: 99）。 PCR技术的应用 1. 基因检测 2. 基因克隆化 3. DNA突变 4. DNA序列分析 …… 思考题 1 简述PCR基本原理? 2