酶切若干问题.docVIP

酶切现象及影响因素详解 (1) 质粒 要是对质粒进行酶切，那么质粒的纯度挺重要，污染有DNase 和残留质粒提取中的酚以及高盐对DNA酶切都不利，还有RNA要去除干净。以上所提的这些这都会影响酶切效果。 解决方法 DNase污染 ：质粒提取的试剂都要进行灭菌，提取时不要拖拉，电泳缓冲液要长换，以免电泳液造成DNA降解，电泳液的pH不要偏酸，容易降解DNA.在最后溶解DNA时，可以采用TE和水，建议用TE，TE可以鳌合金属离子，使DNase失活。酶切时，TE也会有一定影响，但你可以将溶解DNA时的TE少加点。 酶切时，取的DNA的体积就可以减少，经水稀释，就问题不了。 RNA 的去除：一般将RNase加到TE中，经过37度温育一段时间就可以将RNA很好的去除1－2个小时就行。 酚的污染：首先在用酚仿抽提时，就要小心不要吸到下面的有机溶液，要是为了保险可以再用氯仿单独抽提一下，就可以很好的避免酚的残留。 高盐的去除： 提取质粒时一般盐的浓度很高，若有人在70％乙醇洗盐这步不做，也会影响后面酶切。 （2）PCR产物 PCR产物经电泳检测是单一目的条带可以直接酶切，若是杂带很多，就要将目的片段回收再酶切。一般在设计引物的时候，会在5端引入酶切位点，但是不要忘了在酶切位点外面加几个保护碱基。加入4个比较保险，如果没有保护碱基，内切酶是无法切断DNA的，即使加入