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11月13日 引物合成的详解 4.需要什么级别的引物？答：引物常用的纯化方式C18脱盐，OPC纯化，PAGE纯化，HPLC纯化。根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。 应用 引物长度要求 纯度级别要求 一般PCR扩增 45 base OPC 一般PCR扩增 45 base PAGE 诊断PCR扩增 40base OPC, PAGE DNA测序 20base左右 OPC 亚克隆，点突变等 根据实验要求定 OPC, PAGE，HPLC 基因构建（全基因合成） 根据实验要求定 PAGE 反义核酸 根据实验要求定 PAGE 修饰引物 根据实验要求定 PAGE, HPLC 8.如何计算引物的浓度？答：引物保存在高浓度的状况下比较稳定。引物一般配制成10-50pmol/ul。 一般情况下，建议将引物的浓度配制成50pmol/ul，加水的体积（微升）按下列方式计算：V (微升)= OD数*（乘）33 *（乘）*（乘）20000 / (除) 引物的分子量。引物的分子量可以从合成报告单上获得。如果需要配制成其他浓度，按上述公式换算。注意：1 OD260= 33 ug/ml. 9.如何计算引物的Tm值？答：引物设计软件都可以给出Tm，与引物长度、碱基组成、引物使用缓冲的离子强度有关。长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size公式中，Size = 引物长度。11.如何溶解引物？答：干燥后的引物质地非常疏松，开盖前最好离心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，将引物粉末收集到管底。根据计算出的体积加入去离子无菌水或10mM Tris pH7.5缓冲液，室温放置几分钟，振荡助溶，离心将溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸馏水，因为有些蒸馏水的pH值比较低（pH4-5）,引物在这种条件下不稳定。12.如何保存引物？答：引物合成后，经过一系列处理和纯化步骤，旋转干燥而成片状物质。引物在溶解前，室温状态下可以长期保存。溶解后的引物-20度可以长期保存。如果对实验的重复性要求较高，合成的OD数较大，建议分装，避免反复冻融。修饰荧光引物需要避光保存。13.合成的引物5’端是否有磷酸化答：合成的引物5’为羟基，没有磷酸基团。如果需要您可以用多核苷酸激酶进行5′端磷酸化，或者要求引物合成公司合成时直接在5′或3′端进行磷酸化，需要另外收费。14.引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题？连接反应需要引物的5’磷酸基团。如果需要将合成的引物退火直接连接相应的载体上，引物需要磷酸化。磷酸化的产物如果还不能连接载体上，需要检查载体的酶切效果，需要改善引物退火的条件。SiRNA分子具有特殊的对称结构，退火的难度较大，退火时需要提高退火温度。16.长链引物为什么出错的几率非常高？答：引物合成时，每一步反应效率都不能达到100%，产生碱基插入、缺失、置换突变的因素客观条件都有一直存在。引物链越长，突变的频率累加起来就越高。研究人员总希望合成的引物万无一失，这种心情可以理解。但是犹如PCR扩增，不可能绝对保证扩增产物中没有突变，引物合成也不可能保证100%正确。要知道，引物合成中发生错误（非人为因素）的频率，比任何高保真高温聚合酶PCR扩增过程所产生的频率都要高。做引物合成，长链引物合成，您要有引物中部分引物可能有突变的思想准备。19. TaqMan 探针设计的基本原则是什么？答：下列原则供您参考。◆TaqMan 探针位置尽可能靠近扩增引物（扩增产物50-150bp），但不能与引物重叠。◆长度一般为18-40mer 。◆G-C含量控制在40-80%左右。◆避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。◆在引物的5’端避免使用G。◆选用比较多的碱基C。◆退火温度Tm控制在 68-70C左右。有用的荧光染料参数 Name 吸收波长 发射波长 colors 6-FAM （6-carboxy-fluorescein） 494nm 518nm Green TET??（5-tetrachloro-fluorescein） 521nm 538nm?? Orange HEX （5-hexachloro-fluorescein） 535nm 553nm Pink TAMRA（tetramethyl-6-carboxyrhodamine） 560nm 582nm Rose ROX （6-carboxy-x-r