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基因工程操作程序知识总结 目的基因：指编码蛋白质结构基因 基因文库 基因组文库 从基因文库中获取 目的基因的获取 方法 部分基因文库 人工合成 PCR：是一项在生物体外复制特定 DNA片段的核酸合成技术。 利用PCR技术扩增目的基因 目的：获取大量的目的基因 原理：DNA复制 过程 目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可以遗传给下一代， 基因表达载体的构建 并使目的基因能够表达和发挥作用。 （基因工程的核心） 目的基因： 启动子： 基因表达载体的组成： 目的基因： 终止子： 标记基因： 转化：目的基因进入受体细胞内并在受体细胞内维持稳定 和表达的过程 农杆菌转化法 导入植物细胞的方法： 基因枪法 将目的基因导入受体细胞 方法： 花粉通道法 导入动物细胞的方法： 显微注射技术 导入微生物的方法： 检测转基因生物的染色体上是否插入了目的基因 检测：检测转基因生物的染色体上是否插入了目的基因 方法：分子杂交技术（DNA探针+转基因生物DNA） 目的基因的检测和鉴定 检测目的基因是否转录 方法：分子杂交技术（DNA探针+转基因生物mRNA） 检测目的基因是否翻译成蛋白质 方法： 抗原—抗体杂交 外显子与内含子 一般来说，结构基因都是由外显子和内含子组成，但是，外显子和内含子的关系不是完全固定不变的。有时同一条DNA链上的某一段DNA序列，当它作为编码某多肽链的基因时是外显子，而作为编码另一多肽链的基因时，则是内含子，结果是同一基因可以同时转录为两种或两种以上的mRNA。 2．原核细胞的基因结构与真核细胞的基因结构的异同点 ? 原核细胞的基因 真核细胞的基因 不同点 编码区连续；结构简单 编码区有间隔，不连续；结构复杂 相同点 都有编码区和非编码区；编码区都有调控遗传信息表达的核苷酸序列；编码区上游都有与RNA聚合酶结合的位点 考点梳理（一）DNA重组技术的基本工具 1限制性核酸内切酶——“分子手术刀” （1）主要是从原核生物中分离纯化来的。 （2功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并能将每一条链上特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键切开。 （3）切割方式：①在中心轴线两侧将DNA切开，切口是黏性末端。②沿着中心轴线切开DNA，切口是平末端。 2DNA连接酶——“分子缝合针” （1）DNA连接酶的分类：E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。 （2）作用及作用部位：E.coliDNA连接酶作用于黏性末端被切开的磷酸二酯键，T4DNA连接酶作用于黏性末端和平末端被切开的磷酸二酯键。 3运载体（运输工具）：质粒 、噬菌体和动、植物病毒等 （1）必备的条件： ① 能在受体细胞中复制并稳定保存； ② 具有一至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入； ③ 具有标记基因，供重组 DNA的鉴定和选择； ④ 对受体细胞无害，不会影响受体细胞正常的生命活动。 （2）常用运载体——质粒：裸露的，结构简单且独立于细菌DNA之外的，具有自我复制能力的小型环状DNA分子。 二 基因工程的基本操作程序 1目的基因的获取： ① 直接从生物体中提取总DNA，构建基因组DNA文库，从中调用目的基因； ② 以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段，建立cDNA文库； ③ 利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段； ④ 化学合成。 获得原核细胞的目的基因可采取直接分离，获取真核细胞的目的基因一般是人工合成，原因是原核生物基因中无内含子，而真核生物有内含子，在转录时要被剪切掉才能生成成熟的mRNA，动、植物中内含子的剪切方式不一样，如果用直接分离的基因将无法表达；而人工合成的基因是没有内含子的。 2．基因表达载体的构建——重组质粒的构建 （1）表达载体的组成：复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因 复制起始位点即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。 启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质，但启动子本身不被转录 终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录 目的基因中的标记基因最少要有2个，1个是用来检测运载体是否进入了受体细胞，另一个是用来检测目的基因是否被拼接到运载体上；第一个标志基因要保证其完整性，能够进行表达，若受体细胞表现出该基因所控制的性状，说明运载体已进入受体细胞；第二个标志基因是插入目的基因的部位，由于目的基因的插入破坏了其结构，不能表达其所控制的性状，若受体细胞没有表达出第二个基因所控制的性状，说明目的基因已进入受体细胞。常用的标记基因是抗生素基因。 （2）构建步骤： ①用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个有