水塔老陈醋大曲中酵母菌的分离鉴定-20150909.doc

水塔老陈醋大曲中酵母菌的分离鉴定 摘要 目的：大曲是山西著名品牌水塔老陈醋发酵的主要原料，其富含多种微生物，研究大曲中酵母菌的组成对老陈醋的发酵生产有重要的指导意义。方法：采用传统分离培养方法，即通过富集培养再稀释涂布、分离纯化出21株酵母菌，对其进行形态学观察、镜检，并且扩增和测定了它们的5.8S-ITS、18S、26S D1/D2区序列，从分子水平上对这些菌株进行了分类学鉴定。结果：测序结果与GenBank 中已知序列进行比对，鉴定到2株弗比恩酵母，8株扣囊复膜酵母，6株异常威克汉姆酵母，3株葡萄牙棒孢酵母，2株东方伊萨酵母。结论：大曲中含有多种酵母菌，分离培养和分子生物学鉴定了酵母菌的种类，为纯种制曲打下了基础。 关键词：大曲，酵母菌，分离，鉴定 大曲是我国传统酿造酒和酿造食醋生产中主要的原料。大曲是酒和食醋酿造过程中重要的微生物、酶类、香气物质和香气物质前提的主要来源[1-2]。大曲中含有多种微生物，可起到糖化、发酵、增香的作用，直接或间接地影响酒和醋的风味及口感。然而，大曲采用开放式富集培养，受场地、工具和制曲室环境以及水、空气等多种因素影响，大曲质量难以得到稳定，同时富集式培养使大曲富含多种微生物，包括功能性微生物和无效、有害微生物，难以保证大曲的质量稳定[3]。酵母菌是大曲中主要的功能性微生物之一，影响酒和老陈醋的发酵生产及口感。分离鉴定大曲中酵母菌的组成，成了近几年酒和食醋的研究热点[4-9]。分离鉴定水塔老陈醋大曲中酵母菌的组成，对提高著名品牌水塔老陈醋的产量和质量有很重要的意义。 采用富集培养再稀释涂布、分离水塔老陈醋大曲中的酵母菌，之后对其进行形态学观察、镜检，扩增和测定它们的18S、5.8S-ITS、26S D1/D2区序列，从分子水平上对这些菌株进行了分类学鉴定。分子生物学的鉴定方法不仅能够快速的将各种酵母鉴定到属或种, 而且鉴定的结果精确度更高。随着数据库中分子信息量的增加, 近年来应用分子生物学技术鉴定酵母菌种的研究越来越广泛[10-17]。 对酵母菌鉴定最常用的分子系统发育分析方法有18S、5.8S-ITS、26S D1/D2区等。 酵母菌核糖体小亚基18S rRNA 存在不同保守程度序列的镶嵌现象(从高度保守到半保守区到高可变区)，使得该分子可以用来衡量较远的亲缘关系，也适宜于较近的亲缘关系。这个区域大约有1800bp，含有不同变异率的区段，可以用于种、属或更高等级分类群之间的系统关系研究[10-12]。酵母菌ITS区为核糖体内转录间隔区，位于18S rDNA 和26S rDNA 之间，包括ITS1 和ITS2 两个片断，中间包含一个5.8S rDNA 片段。ITS 区域与rDNA 转录区相比具有较高的变异率，对于亲缘关系较近的菌株间的区分是比较有效的。研究表明ITS 区域的差异大于1% 时就可能代表不同的种，然而对于不同的属而言，情况会有所不同[11-18]。26S rDNA 的 Dl/D2 区域位于大亚基的5端，序列长度在600bp 左右，该段区域具有较高的变异率，可以用于亲缘关系较近的菌株之间的分类研究，目前已经成为酵母鉴定和系统发育分析的重要“标尺”。虽然酵母种内26S D1/D2 区碱基差异小于1%的标准已被普遍接受，然而此数值仍是一个试验的经验值[11-13,19-20]。 本研究采用传统分离培养和分子生物学相结合，分离鉴定著名品牌山西水塔老陈醋大曲中酵母菌的种类，研究与老陈醋发酵产香等相关菌种，同时也为食醋传统工艺的研究、改造、纯种制曲等提供指导。 1材料与方法 1.1 材料与仪器设备 1.1.1 样品和主要试剂 大曲由山西水塔醋液股份有限公司提供。YPD培养基购自北京博奥星。Dream Taq Green PCR Master Mix购自Fermentas; Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR购自宝生物工程有限公司；其它试剂购自北京化工厂。 1.1.2 仪器设备 灭菌锅，无菌工作台，生化培养箱，摇床，分光光度计，荧光显微镜（重庆奥特光学），GeneAmp PCR System 2720 ( ABI ) ，ChampGel凝胶成像分析系统（北京赛智）。 1.2 方法 1.2.1 培养基和样品制备 富集培养基 酵母粉1%，葡萄糖2%，蛋白陈2%，调pH至4.5培养基灭菌后再加入链霉素（终浓度30 ug/ml）、青霉素（终浓度为50 ug/ml），孟加拉红0.033 mg/mL，以抑制细菌和霉菌生长。 分离培养基 YPD培养基：酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，琼脂粉2%。葡萄糖单独115℃灭菌15 min，然后加入培养基中，倒平板。 样品的处理 将曲块经过碾压研磨后混匀过40目筛，保