生化技术重点1.doc

1、 紫外-可见光分光光度法在有机化合物中的应用，多数都是建立在π→π*和n→π*跃迁的基础上。π→π*跃迁与n→π*跃迁的重要区别①摩尔吸光系数不同：π→π*摩尔吸光系数在104左右，n→n*跃迁的摩尔吸光系数小，在10-100范围②溶剂的极性对这两种跃迁的吸收峰波长影响不同（溶剂效应）：溶剂极性增加时，π→π*红移，n→π*蓝移。 2、 原子吸收分光光度法与紫外可见分光光度法的比较 本质：原子吸收/分子吸收；谱带：线状光谱/带状光谱；光源：锐线光源/连续光源；被测物状态：原子状态原子蒸气/分子状态、溶液；仪器结构：分光系统在原子化器之后/分光系统在比色杯之前；温度：高温/常温 3、离子选择性电极的一般作用原理：当电极置于溶液中时，电极膜与溶液界面的离子交换和扩散作用，改变两相界面原有电荷分布形成双电层产生膜电位；因参比电极电位固定，所以ISE只随溶液中待测离子活度或浓度变化而变化。 4、简述聚丙烯酰胺凝胶电泳的优点 1具有分子筛作用，分离效果好 2设备简单，样品用量少，不易扩散，分辨率高 3不带电荷，几乎没有电渗作用 4可通过控制凝胶浓度来调整凝胶的孔径，以适合不同分子量样品的分离 5化学稳定性好，由于分子结构中富含酰胺基，聚丙烯酰胺凝胶是一种稳定的亲水胶体 6机械性强度好，有弹性，无色透明，易观察，可用检测仪直接测定。 5、高效液相层析法HPLC与气相色谱法GC的比较 a共同点：①色谱的基本理论一致②定性定量原理完全一样③自动化程度高 b流动相差别：GC用气体做流动相，气体与样品分子之间作用力可忽略，载气种类少性质相近，改变载气对柱效和分离效率影响小；HPLC以液体做流动相，液体分子与样品分子之间作用力不可忽略，液体种类多性质差别大，是控制柱效和分离效率的重要因素之一，使HPLC除了固定相的选择外增加了一个可供选择的重要操作参数 c固定相差别 d使用范围更广。GC一般分析沸点500c以下，相对分子量少于450的物质，而对热稳定性差易于分解变性及具有生理活性的物质都不能用升温气化的方法分析。HPLC在室温或接近室温的条件下工作，可分析沸点在500c以上相对分子质量在450以上的有机物质，范围远远超过GC。 E原理和结构差别。 7、如何选择内标物？内标法优缺点。 对内标物的要求是纯度高，结构与待测组分相似。内标峰要与组分峰靠近但能很好分离，内标物和被测组分的浓度相接近。 内标法的优点是定量准确测定条件不受操作条件、进样量及不同操作者进学技术的影响。缺点是选择合适的内标物较困难，每次需准确称量内标物和样品增加了色谱分离条件的难度。 8、何为层析技术？如何分类？ 概念：基于物质的物理化学和生物学特征的不同，在某种介质中的移动速度不同进而对物质进行分离和分析的技术，即层析技术 分类：①按流动相和固定相的状态分类：液相层析法、气相层析法②按层析法分离原理分类：分配层析法、吸附层析法、亲和层析法、凝胶层析法、离子交换层析法③按操作方式不同分类：纸层析法、薄膜层析法、薄层层析法、柱层析法 9、米氏常数在酶学分析中的意义？ km是酶极为重要的动力学参数。意义：1鉴别酶的最适底物2由于存在km值不同而功能相同的酶从而发现同工酶3判断细胞内酶的活性是否受底物抑制4测定不同抑制剂对某个酶km及Vmax的影响可以区别该抑制剂是竞争性抑制剂还是非竞争性抑制剂5已知某个酶的km，可以计算出某个底物浓度时。其反应速度相当于最大速度的分数6利用工具酶来测定体液中某一成分的浓度或某一种酶活力时，可以根据衍生出来的公式计算工具酶所需要的活力单位7设计适宜的底物浓度。 10、何谓酶活性测定的固定时间法和连续监测法？各有何优缺点？ 固定时间法：测定酶反应开始后某一时间内产物或底物浓度的总变化量来求取酶反应初速度的方法。优点：简单因最后测定产物时酶反应已经终止，故分光光度计可无需保温装置，显色剂的选择也可以不考虑对酶活力的影响。缺点：因为不用预实验确定，无法了解酶作用的这段时间内是否都是零级反应，难保证测定结果的真实性。 连续监测法：酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间的变化来求出酶反应速度的方法。优点：可将多点的测定结果连接成线，很容易找到成直线的区段，可以观察到是否偏离零级反应可选择线性反应期来计算酶活力，不需要终止反应。缺点：对仪器要求高，PH和底物对反应有影响，仪器要恒温。 11、酶偶联测定中常用指示酶？常检测的指示反应？ 利用氧化还原酶反应原理连接到NAD P +-NAD P H的反应后直接通过分光光度法或其他方法测定NAD P H的变化量。1、NAD P +或NAD P H偶联的脱氢酶及其指示反应，这类方法基于NADH或NADPH在340nm处有特征性的吸收峰而NAD+或NADP+在300和400nm之间没有吸