DNA的粗提取和鉴定姜姜预案.ppt

* 1、如何观察DNA和RNA在真核细胞中的分布情况? 2、真核细胞DNA的主要存在场所? 3、证明DNA是遗传物质的三个经典实验? DNA的粗提取与鉴定 实验思路 1、DNA从哪提取？ 2、怎样将DNA与细胞中的其他物质分离？ 3、怎样鉴定我们提取的DNA？ 一、基础知识 （一）提取DNA的方法 1.提取生物大分子的基本思路 选用一定的物理或化学方法，分离具有不同物理或化学性质的生物大分子 2.提取DNA的基本思路 提取DNA，去除其他成分 利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异 基础知识： DNA粗提取的原理 提取DNA的原理包括DNA的溶解性和耐受性两个方面。 ①思考在什么浓度下，DNA的溶解度最小？ DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何变化的？ DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线图 在NaCl溶液浓度低于0.14 mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；在0.14 mol/L时，DNA溶解度最小；当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大。 在溶解细胞中的DNA时，人们通常选用2mol/LNaCl溶液；将DNA分子析出的方法是向溶有DNA的NaCl溶液中缓慢注入蒸馏水，以稀释NaCl溶液。 〖思考2〗 酒精是一种常用有机溶剂，但DNA却不能溶于酒精.但细胞中蛋白质可溶于酒精。问：采用DNA不溶于酒精的原理，可以达到什么目的？ 将DNA和蛋白质进一步分离 〖思考3〗 提取DNA还可以利用DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性原理。利用该原理时，应选用怎样的酶和怎样的温度值？ 蛋白酶，因为酶具有专一性，蛋白酶只水解蛋白质而不会对DNA产生影响 温度值为60～80℃，因为该温度值蛋白质变性沉淀，而DNA不会变性。 DNA不溶于酒精溶液， 但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。 将DNA与蛋白质进一步分离。 DNA不溶于酒精溶液 DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性 ① 蛋白酶——水解蛋白质， 对DNA没有影响 ② 高 温——大多数蛋白质不能忍受60～80℃ 而DNA在80℃以上才会变性 ③ 洗涤剂——溶解细胞膜，去除脂质和蛋白质 但对DNA没有影响 试剂： （二）DNA的鉴定 条件： 二苯胺 沸水浴条件下，DNA遇二苯胺被染成蓝色 沸水浴 现象： 原理总结: 通过利用不同浓度NaCl溶液溶解或析出DNA，可以从细胞中提取和提纯DNA；再利用酒精进一步将DNA与蛋白质分离开来，达到提纯的目的；最后利用二苯胺试剂鉴定提取的物质是否是DNA （一）实验材料的选取 （二）破碎细胞，获取含DNA的滤液 （三）除去滤液中的杂质(纯化) （四） DNA的析出与鉴定 二、实验设计 （一）实验材料的选取 原则 鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌 凡是含有DNA的生物材料都可以考虑。选用DNA含量相对较高的组织，成功的可能性更大 制备鸡血细胞液 取质量浓度为0.1g/ml的柠檬酸钠溶液（抗凝剂）100ml，置于烧杯中，将新鲜鸡血注入，同时用玻璃棒搅拌，以免凝血，然后倒入离心管中用1000r/min的离心机离心2min，此时，血细胞沉淀于离心管的底部，除去上清液，就可以得到鸡血细胞液。 （二）破碎细胞，获取含DNA的滤液 1、动物细胞 2、植物细胞 ——需要溶解细胞膜 鸡血细胞液：加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液 想一想：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？ 蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体， 水分大量进入血细胞，使血细胞胀裂； 加上搅拌的机械作用，加速鸡血细胞细胞膜、核膜破裂，从而释放出DNA ① 加入一定的洗涤剂和食盐 ② 充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液 想一想：洗涤剂和食盐的作用分别是什么？ 洗涤剂——离子去污剂，能溶解细胞膜，利于DNA释放 食 盐——NaCl，利于DNA的溶解于研磨液中 ——容易破碎 使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等 为了纯化提取的DNA需要将滤液作进一步处理 讨论：滤液/研磨液中可能含有哪些成分？ 可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质 想一想：如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？ （三） 去除滤液中的杂质 阅读教材提供的三种方法，分析其中的原理。 讨论：为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质 用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质 讨论：方案二与方案三