抗鳗利斯顿氏菌鸡卵黄抗体制备及其活性研究.docVIP

抗鳗利斯顿氏菌鸡卵黄抗体制备及其活性研究 周永强，李登峰(,刘联国，郭安南，陈炯，王重彬 （宁波大学应用海洋生物技术教育部重点实验室， 浙江 宁波 315211） 摘要：鳗利斯顿氏菌(Listonella anguillarum)是常见的水产动物致病菌。为获得高效抗鳗利斯顿氏菌卵黄抗体(egg yolk antibodies, IgY)，用纯培养的鳗利斯顿氏菌制备抗原，免疫蛋鸡，联用乙酸-乙酸钠稀释、(NH4)2SO4与Na2SO4盐析、透析法由蛋黄分离纯化卵黄抗体。对制备的IgY进行了体内、外抑菌活性与吞噬调理作用研究：分别将抗鳗利斯顿氏菌IgY、普通鸡蛋提取的IgY与鳗利斯顿氏菌（103 CFU/ml）等体积混合后注射克氏原螯虾(Procambarus clarkia)，计算成活率；分别将抗鳗利斯顿氏菌IgY、普通鸡蛋提取的IgY与鳗利斯顿氏菌（106 CFU/ml）及血细胞混合后，接种平板培养、计数。结果表明：提取的IgY浓度为8.93mg/ml，每个鸡蛋可获得IgY约120mg，抗体纯度较高，效价为1:20480；对鳗利斯顿氏菌的体外抑菌率为65%；能促进细胞对鳗利斯顿氏菌的吞噬，相对吞噬率为75%；对克氏原螯虾的保护率为33.3%。 关键词: 鳗利斯顿氏菌; 卵黄抗体；制备；抑菌活性；吞噬调理 中图分类号： S94 文献标识码： A 鳗弧菌L. anguillarum)引起的水产养殖动物疾病在世界范围内流行，可感染抗生素替代品成为当前研究的( immunoglobulin of yolk, IgY)是抗生素的最佳替代品。自1893年Klemperer首次报道鸡蛋中存在抗体以来，卵黄抗体的研究不断深入，IgY的形成机制、生物学特性等方面已研究的比较清楚。IgY作为防治药物和诊断试剂的研究和应用愈来愈受到关注[5-13]。卵黄抗体可用于治疗由细菌、病毒、寄生虫等病原体引起的疾病，具有安全高效、无残留、不产生抗药性，服用简便等优点。针对卵黄抗体专一性强的特点，可以制备不同病原的卵黄抗体，对症下药，达到全面防治的效果。卵黄抗体在许多疾病尤其烈性、急性、危害性比较大的疫病（包括新城疫、传染性法氏囊病、小鹅瘟、鸭病毒性肝炎及脑脊髓炎、犬瘟热、猪瘟、泌乳期牛的乳房炎、牛腹泻、产肠毒素性大肠杆菌引起的仔猪腹泻等）的防治上已有成功尝试[14-19]。已有众多人、畜用卵黄抗体制剂获得批准进入市场。水产养殖动物病原卵黄抗体研究相对落后，报道较少。本研究以灭活的鳗利斯顿氏菌纯培养物作为抗原，制备抗鳗利斯顿氏菌IgY，探讨其抑菌、吞噬调理效果，以期为鳗利斯顿氏菌病害的防治奠定基础。 材料与方法 材料 鳗利斯顿氏菌菌种：本实验室由香鱼(Plecoglossus altivelis)中分离、纯化、鉴定后超低温冰箱保存；海兰白蛋鸡(Hyline White Laying hens)：购于宁波慈溪益大养殖场；克氏原螯虾(P. clarkia)：购于宁波大学菜市场，体长8-10cm，附肢完整，实验室暂养1-2周仍然健壮，无死亡个体后，投入试验；血细胞：以肝素为抗凝剂，用1ml一次性无菌注射器由静脉抽取健康鸡血，离心并用PBS清洗后，用生理盐水悬浮。若干（1-2ml），加入，实验前立刻配制使用以防止失活；辣根过氧化酶标记羊抗鸡抗体：购于北京博奥森生物公司；LB培养基自配：酵母膏 5g，蛋白胨 10g琼脂 g，加双重水 1000ml，调pH至7.2；乙酸-乙酸钠（pH 5.0）：加2.86ml乙酸，乙酸钠2.324g，以1000ml双重水溶解，用20%NaOH调pH至5.0； ELISA试剂:包被缓冲液：0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液(CBS)：Na2CO31.59g，NaHCO3 2.39g 定容至1000ml；洗涤液(pH7.4 PBST)：NaCl8.0g，KCl0.2g，KH2PO40.2g，Na2HPO4.12H2O 2.9g，Tween-20 50μl 定容至1000ml；封闭液：(1%BSA)1.0g牛血清白蛋白加100ml洗涤液；磷酸盐-柠檬酸缓冲液(pH 5.0)：柠檬酸19.2g，Na2HPO4 12H2O 71.2g 定容1000ml；底物溶液：40mg邻苯二胺(OPD)溶于100ml磷酸盐-柠檬酸缓冲液，用时加30% H2O2 150μl；终止液：2mol/L H2SO4溶液。 实验方法 1.2.1 蛋鸡免疫 取鳗利斯顿氏菌菌种进行活化培养，稀释平板法计数，0.9%生理盐水洗涤3次，调整浓度为2×109CFU/ml。加入终浓度0.5%的甲醛，混匀后于37℃恒温水浴灭活24h，经检验无活菌后按体积比1:1加入弗氏佐剂，振荡乳化后对SPF海兰白蛋鸡免疫，免疫分3次，首次用弗氏完全佐剂，后两次用弗氏不完全佐剂，