银染方法总汇及注意事项.docVIP

ptotocol是这样的，请看哪里不妥： 蛋白银染步骤 步骤 溶液 时间 固定 甲醇 100ml 冰醋酸 25ml 加双蒸水至250ml 30min 冲洗 双蒸水 3次 敏化 甲醇 75ml 戊二醛（25%w/） 1.25ml 硫代硫酸钠 5%w/ 10ml 醋酸钠（17g） 加双蒸水至250ml 30min 冲洗 双蒸水 3次 银反应 硝酸银溶液 2.5%w/ 25ml 甲醛 37%w/ 0.1ml 加双蒸水至250ml 20min 冲洗 双蒸水 2次 显色 碳酸钠 6.25g 甲醛 37%w/ 0.05ml 加双蒸水至250ml 2-5min 终止 EDTA-Na22H2O 3.65g 加双蒸水至250ml 10min 冲洗 双蒸水 3次 建议使用silia的方法！！ 简单，快！ 本人的银染方法： 1. 固定：100ml MeOH, 24ml H Ac, 56ml 0.04%HCHO, 20ml ddH2O,洗三次，每次 20分钟； 2. 50％EtOH洗PAGE胶三次，每次20分钟； 3. 预处理：0.02％ Na2S2O3 处理一分钟； 4. 水洗：ddH2O漂洗三次，每次20秒； 5. 染色：0.8ml 20％AgNO3+72ml 0.04%HCHO处理PAGE胶20分钟； 6. 水洗：同上； 7. 显色：25ml 12％Na2CO3, 24ml 0.04%HCHO, 1ml 0.02％ Na2S2O3, 漂洗10－15分钟； 8. 水洗：同上； 9. 终止：50％MeOH, 12％H Ac,10分钟。 以上步骤从中科院生化所学来，过程和silia 的基本一致，不知道是否有出入，请大家指正。谢谢！！！ 5.2.2.3 银染色 1 银染液1（1000ml） ： 甲醇50％ 乙酸12％ 甲醇 500ml 冰醋酸 120ml 2 银染液2（1000ml）： 甲醇30％，乙酸钠0.4M，戊二醛0.5%，硫代硫酸钠0.1%， （含乙酸 1－2ml） 甲醇300ml 乙酸钠54.4g 戊二醛10ml 硫代硫酸钠1g 乙酸1－2ml 3 显色液 1000ml 无水碳酸钠2.5% 甲醛 0.02% 无水碳酸钠25g， 甲醛1.5ml 4 硝酸银（100ml）： 20%硝酸银 （过滤后待用） 染色步骤： 1 银染液1 洗2次， 每次5分钟 2 银染液2 洗1次，每次30分钟 3 超纯水 洗2次， 每次1分钟 4 0.5%硝酸银 洗30分钟 5 超纯水洗5次，每次1分钟 （关键步骤，共计5分钟）显色液显色 6 看到各条带，则倾去显色液, 1％ 乙酸中止 我感觉浸银后、显色前的水洗非常关键，时间不能太长，次数不能太多，否则可能会染不上颜色。但水洗不充分又可能导致背景较深。 我个人一般是用水洗三遍，每次半分钟左右。 固定液：50%乙醇，10%冰醋酸，40%水 浸泡液：30%乙醇，6.8% NaAc，50%戊二醛 0.625ml，0.2% NaS2O3?5H2O 银染液：0.1% AgNO3，0.02% 甲醛 显色液：2.5% Na2CO3，0.01% 甲醛 终止液：1.46% EDTA-2Na?2H2O silia wrote: 我室固定的蛋白银染方法，效果很不错，也很简单，步骤如下： 1）PAGE胶切下后用50％乙醇（100ml左右）洗三次，每次20分钟 2）2％硫代乙醇酸钠稀释50倍作用1分钟，双蒸水洗3次，每次20秒 3）2％硝酸银稀释10倍作用20分钟，双蒸水洗3次，每次20秒 4）6％碳酸钠溶液显色，直到条带清晰为止，一般几分钟，大量水冲洗 5）加中止液10％乙酸中止即可 银染的方法种类很多，目前有文献报道的就有 100 多种。但是其准确的染色机制还不是特别的清楚。大致的原理是银离子在碱性pH 环境下被还原成金属银，沉淀在蛋白质的表面上而显色。由于银染的灵敏度很高，可染出胶上低于1 ng/蛋白质点，故广泛的用在2D 凝胶分析上，及极低蛋白含量测定的垂直凝胶中。这里介绍的是我们实验室成功运用的银染方法，对关键操作及要求做了补充！主要是用于垂直凝胶电泳中低丰度蛋 白的检测！如内源性GST-Pulldown、Co-IP等实验中相互作用蛋白的研究 银染操作规程 实验目的：检测聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质。 实验原理：在碱性条件下，用甲醛将蛋白带上的硝酸银（银离子）还原成金属银，以使银颗粒沉积在蛋白带上。染色的程度与蛋白中的一些特殊的基团有关，不含或者很少含半胱氨酸残基的蛋白质有时候呈负染。银染的详细机制还不是非常清楚。 试剂：乙醇、冰醋酸、乙酸钠、硫代硫酸钠、硝酸银、碳酸钠、甘氨酸或EDTA.Na2.2H2O、甲醛 实验操作程序： 固定：30min或者更长时间 100ml 乙醇 40% 乙醇 25ml冰醋酸