大肠杆菌工程菌发酵工艺中诱导条件的研究pdf.docVIP

第 20卷第 2期 四川文理学院学报 2010年 03月 Vol. 20 No. 2 S ichuan Un iversity of Arts and Sc ience Journa l M ar. 2010 大肠杆菌工程菌发酵工艺中诱导条件的研究 王晓洲 ,刘　丹 (四川文理学院化学与化学工程系 ,四川达州 635000) 摘　要 :通过比较在分批发酵中分别加入诱导剂 IPTG0. 3mM 和 0. 5mM 与诱导时间为 3h和 4h的不同组 合 ,观察其对重组蛋白表达的影响 ,从而筛选出目的蛋白高效表达的最佳条件. 实验表明 ,工程菌在对数生长的 中后期 (OD600为 4)时添加终浓度为 0. 5mM 的 IPTG诱导对蛋白的表达最为有利. 关键词 :发酵 ; IPTG;诱导;目的蛋白 中图分类号 : O6 - 3　　　　文献标志码 : A 　　　文章编号 : 1674 - 5248 ( 2010) 02 - 0046 - 03  　　大肠杆菌是基因工程中常用的宿主菌 ,许多有价值的 多肽和蛋白在大肠杆菌中已成功地进行了表达 ,表达水平 有些高达细胞总蛋白的 30%以上. 大肠杆菌作为外源基 因表达的宿主 ,由于具有遗传背景清楚 ,目的基因表达水 平高 ,技术操作、培养条件简单 ,抗污染能力强 ,大规模发 酵经济等优点 ,倍受遗传工程专家重视 ,是目前应用最广 泛 ,最成功的表达体系. [ 1 - 4 ] 提高外源基因表达水平 ,就是将宿主菌的生长与外源 基因的表达分成两个阶段 ,以减轻宿主菌的负荷. 常用的 方法有温度诱导和药物诱导. IPTG为异丙基硫代 - β - D - 半乳糖苷 ,是 β - 半乳糖苷酶底物的类似物 ,有很强的 诱导力 ,在有 IPTG诱导物存在的条件下 ,诱导物可与阻遏 蛋白结合成复合物 ,而使阻遏蛋白构象发生改变 ,阻遏蛋 白就不能再与 O 基因结合 ,从而促进基因表达. 本实验采用 IPTG诱导外源基因表达 ,研究不同浓度 的 IPTG与不同诱导时间的组合下 ,通过摇瓶培养和发酵 罐分批发酵两种不同的发酵方式 ,观察其对目的蛋白的表 达的影响. 1 　材料和方法  NaCl5g,溶于 500m lH2 O , NaOH 调节 pH7. 0, 2L 三角瓶装 , 灭菌锅湿热高压灭菌 121℃, 20m in,室温保存. TB 培养基 (发酵培养基 ) : 胰蛋白胨 240g, 酵母粉 480g, 甘油 80g, 消泡剂 1m l, 溶于 H2 O , 定容至 19L , B. B raun发酵罐在位灭菌 121℃, 15m in. 1. 1. 2　试剂 诱导剂: IPTG (干粉 ) 1. 5g, 溶于灭菌 TB30m l, 100m l 三角瓶装 ,随用随配制. AM P (氨苄青霉素 ) : 80万单位的溶于 5m ldH2 O ,配制 成 16万单位 /m l. 染色剂 (考马斯亮蓝 ) : 乙醇 5% 　考马斯亮蓝 R - 250 (B io - Rad或 Pierce) 乙酸 10% H2 O 40% 脱色剂:乙醇 30% 　乙酸 10% dH2 O 60% 蛋白 M aker 1. 2　工程菌的培养方法 1. 2. 1　三角摇瓶培养 原理:液体培养基 ,接上菌种后 ,在摇床振荡培养 ,一 段时间后 ,菌密度增大 ,培养液变浑浊. 优点:摇床可控制温度 ,晃动可增大培养液里的溶氧 ,  1. 1　材料 缩短培养时间. 1. 1. 1　菌种和培养基 各取菌液 0. 2m l于微量离心管中 , 7000 rpm, 5m in,去掉 DG13工程菌由本实验室自行构建并保存. 上清液 ,在沉淀加入 50μl去离子水后混匀 ,加入等体积的 LB 培养基 (种子培养基 ) :胰蛋白胨 5g,酵母粉 2. 5g, 还原型上样 Buffer,沸水中加热 10m in,进行 SDS凝胶电泳. 3收稿日期: 2009 - 06 - 31 基金项目:四川文理学院院级重点项目《共振瑞利散射光谱法在糖类分子识别的研究》( 2008A05Z ) 作者简介:王晓洲 ( 1976—) ,女 ,四川达州人。助理研究员 ,硕士 ,主要从事分析化学研究。 46 ? 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 王晓洲 ,刘　丹:大肠杆菌工程菌发酵工