流感病毒分离标准作规程.docVIP

流感病毒分离标准操作规程 SOP 病毒分离分离病毒是诊断病毒性疾病最常用，并且高度敏感的方法之一。分离出的病毒须经免疫学、基因分析或电子显微镜等进一步鉴定确诊。病毒可长期保存，亦可用来作抗原性、基因特性或药物敏感性等分析。病毒分离亦受一定限制。目前用于分离病毒的组织细胞种类有限，每种细胞只能用来分离培养一或数种病毒。MDCK（狗肾细胞）是目前用于分离培养流感病毒最常用的细胞系。分离流感病毒最常用的活体是鸡胚，目前有些实验室用MDCK细胞代替鸡胚分离培养流感病毒。由于MDCK细胞属肿瘤细胞系，故用该细胞分离的病毒不能用于疫苗生产。各实验室应同时采用鸡胚和MDCK两种方法分离病毒，不应放弃用鸡胚分离病毒的方法。流感病毒细胞分离标准操作规程材料：1、细胞瓶或细胞管培养成片的MDCK细胞2、TPCK处理胰酶（牛胰腺来源XIII型）Sigma Cat. # T-86423、HEPES 缓冲液, 1 M 母液 GIBCO BRL Cat. # 15630-0234、D-MEM培养基，GIBCO BRL Cat. # 11965-0925、青、链霉素母液 10,000 U/ml 青霉素 G; 10,000 μg/ml 硫酸链霉素 ，GIBCO BRL Cat. # 15140-0236、牛血清白蛋白组分V, 7.5%溶液，GIBCO BRL Cat. # 15260-0117、放置于2ml wheaton 小瓶中的临床样品8、T-25培养瓶用于病毒培养，（组织培养管也可被应用，若样本量大的话应选用培养瓶，细胞数量按规定调整。）9、1ml 滴管10、10ml 滴管培养基和试剂的准备：（建议：要求经常检查试剂使用的有效期）500 ml D-MEM液中加入：青、链霉素母液5 ml 终浓度达: 100 U/ml 青霉素and 100 μg/ml 链霉素 牛血清白蛋白12.5 ml 终浓度: 0.2 % HEPES缓冲液12.5 ml 终浓度: 25 mM 病毒生长液：每500毫升不含血清的D-MEM液之中加0.5 ml of TPCK-胰酶（母液浓度为2mg/ml ）使TPCK-胰酶的浓度为2 μg/ml。方法：（所有有关病毒分离的操作都应在生物安全实验室中进行，必须遵守生物安全规定，严格执行标准操作规程和废弃物管理规定。进入生物安全实验室要求着必要的个人防护用品：穿工作服、工作鞋、戴帽子、口罩和防护眼镜）程序： 细胞培养瓶的准备1、显微镜检查细胞生长状态，40倍放大。2、用病毒培养液替代细胞生长液，保证使用合适的病毒培养基。3、轻轻倒出细胞生长液于广口瓶中，用6 ml of含2 μg/ml of TPCK-胰酶的D-MEM液洗细胞3遍。 细胞培养瓶的接种1、用无菌的移液管将D-MEM从细胞培养瓶中移出。2、用无菌的移液管吸取200 μl临床样品置于细胞培养瓶中。3、接种物37吸附30分钟。4、加6 ml of含2 μg/ml of TPCK-胰酶的不含小牛血清的完全D-MEM液于细胞培养瓶中。5、每细胞培养物的收获日检测细胞病变。（细胞病变的特征是细胞肿胀圆化，细胞间隙增大。细胞核固缩或破裂。严重时细胞部分或全部脱落） 细胞培养物的收获1、当细胞病变为3+或4+时，收获细胞悬液并加稳定剂如：甘油或终浓度为0.5%的牛血清白蛋白。即使无细胞病变也应该于6-7天收获。2、进行红细胞凝集实验并4保存。如没有红细胞凝集现象在报告不能从样品中分离病毒前，应再传代2-3次。3、如果有必要，应3000转离心5分钟以去除剩余的细胞。通过血凝抑制实验鉴定分离物，并在收获的一天间将分离物保存在-70条件。流感病毒鸡胚分离标准操作规程材料：鸡胚10日龄照卵灯70%酒精针头, 22 号, 1? 英寸1ml注射器鸡卵开孔器胶水或清漆15ml 管和架子10ml 移液管无菌镊子方法：（所有有关病毒分离的操作都应在生物安全实验室中进行，必须遵守生物安全规定，严格执行标准操作规程和废弃物管理规定。进入生物安全实验室要求着必要的个人防护用品：穿工作服、工作鞋、戴帽子、口罩和防护眼镜）程序：I.验卵1、用照卵灯检测鸡胚，并将鸡胚的盲端放置在蛋盘上。2、如果鸡胚是没有受精、有裂痕、发育不全、或表面有好多渗水孔，应掉。II.鸡胚接种1、将鸡胚的盲端放置在蛋盘上，标记每个鸡胚用特定的鉴定数量（通常每个样本接种3个鸡胚）。2、用70%乙醇消毒鸡胚，在气室端钻孔。每份标本接种3个鸡胚。3、用注射器吸1ml处理过的临床标本，装上22 号（ 1? 英寸）针头。4、将鸡胚置于蛋架上，用短促动作刺破鸡胚羊膜，将100 μl临床标本注入鸡胚羊膜腔。将针头退出至? 英寸，将另外100