哺乳动物细胞自噬的研究方法【参考】.docVIP

哺乳动物细胞自噬的研究方法 摘要： 细胞自噬参与多种生理和病理过程。因此，科学研究中需要对细胞自噬进行精确识别、定量以及对自噬过程进行操作。然而，因为细胞自噬是动态和复杂的过程，所以对其进行的分析经常是不准确的。在本文中，我们讨论监控细胞自噬和调控细胞自噬活动的方法，尤其关注哺乳动物细胞巨型自噬。 前言 过去十年，对称之为自噬的细胞基本生物学过程有了“爆炸”性的研究。细胞自噬过程中所必需的进化保守基因的发现（最先在酵母中确认），促使科学家揭示了一系列关于细胞自噬对内环境稳态、发育过程以及其他生理功能的影响。此外，更多的证据提示细胞自噬的异常可以引起很广泛的哺乳动物疾病(Levine and Kroemer, 2008; Mizushima et al., 2008)。因此，科学家就急迫需要对多种多样生物过程中的细胞自噬进行检测及功能研究，尤其是在哺乳动物中。 哺乳动物细胞自噬研究历来受两个主要因素的困扰。第一，用静态的检测手段捕获一个动态的过程本身就是一个困难，以及基于这些检测手段的生物学干预的先天性限制。第二，区分形态和功能是另一个挑战，在特定的生理条件下对细胞自噬的研究中，要避免由于检测手段的缺陷将这种生理功能认定为细胞自噬。过去我们对哺乳动物细胞自噬功能的误解主要是以上两种原因导致的。比如，在特定的神经、肌肉退行性疾病中，由于细胞自噬早期中间产物积累增多，似乎代表了细胞自噬通路后期阶段被抑制，这些疾病就被认为或部分被认为是由于细胞自噬增多引起（基于细胞自噬过程中早期中间产物数量的增多）(Levine and Kroemer, 2008; Mizushima et al., 2008; Rubinsztein, 2006)。细胞自噬是一种常见的细胞死亡过程中的形态特征，经常被错误的认定为是一种细胞死亡通路，然而现在可以明确细胞自噬主要功能之一是：在恶劣条件下，细胞自噬使细胞能存活(Kroemer and Levine, 2008)。 在阐明细胞自噬分子机制过程的研究中，由于新技术方法的发展和应用，过去研究细胞自噬的部分困难被克服。因此在过去十年里，针对细胞自噬动态过程的观察和在特定细胞过程中研究调控细胞自噬功能的多种新技术应运而生。本文的目的是综述目前研究哺乳动物细胞自噬的各种实用技术以及这些技术在解释细胞自噬中的局限。关于每种技术的具体细节可以参照以下其他综述(Klionsky et al., 2008a; Mizushima, 2004; Mizushima and Yoshimori, 2007; Rubinsztein et al., 2009)。 细胞自噬引言 细胞自噬是一个描述包括细胞器在内的胞浆物质进入溶酶体而被降解过程的通用术语(Levine and Kroemer, 2008; Mizushima et al., 2008; Rubinsztein, 2006)。在巨型自噬、微型自噬和分子伴侣介导型自噬这三种细胞自噬类型中，巨型自噬的研究最为深入。分子伴侣介导型自噬过程中，胞质蛋白借助分子伴侣的蛋白折叠效应直接跨膜进入溶酶体。微型自噬涉及溶酶体膜的内陷，膜的内陷可以使一部分细胞质进入溶酶体。 巨型细胞自噬（文中以下部分简称细胞自噬）是本文关注的重点。从酵母到哺乳动物，细胞自噬是一个由自噬体介导的保守过程。起初，被称为独立膜或吞饮泡的小囊泡逐渐延伸并包裹胞浆，最后形成双层膜结构的自噬体（图1和图2）。随后，自噬体的外层膜与溶酶体融合形成自噬溶酶体，介导被包裹物质连同自噬体内层膜的降解。自噬体在于溶酶体结合之前也可以同内涵体融合。由自噬降解产生的氨基酸和其他小分子物质重新运回胞浆中被再利用或产能。以下描述的方法用于检测自噬过程的不同阶段的物质包括早期自噬体、自噬溶酶体和自噬降解产物，我们应该综合应用这些实验方法避免错误的解释实验结果，比如自噬中间产物的增多是否能说明细胞自噬的真正增加，或者自噬最后完成阶段的阻滞（图3和图4）。 在生理条件下，细胞自噬具有许多重要作用比如在饥饿状态、胚胎植入前和发育过程中维持氨基酸库的稳定、抑制神经退行性病变、抗衰老、肿瘤抑制、细胞内微生物的清除以及先天固有免疫和后天适应免疫的调节(Cecconi and Levine, 2008; Deretic and Levine, 2009; Levine and Kroemer, 2008; Mizushima et al., 2008; Rubinsztein, 2006) 。细胞自噬特征之一是它的动态调节；在基础状态下，细胞自噬水平很低，但是自噬可以被很多刺激因素明显激活。无论是从酵母到哺乳动物的培养细胞还是完整的有机体，细胞自噬最常见的诱导因素是营养饥饿。除了饥饿激活细胞自噬外，激活细胞自噬的因素还包括其他生理性应激刺