分子生物学实验报告【参考】.doc

分子生物学实验报告 题 目:围绕Southern杂交的系列分子实验 院(系): 创新实验学院 专业年级: 2013级生物技术基地班 姓 名: 姚国财 学 号: 2013015417 指导教师: 潘君风 2015年月日目录 摘 要 5 1.前言 5 2.实验 5 2.1 实验材料 5 2.2 试剂 5 2.2.1RNA分离与纯化 5 2.2.2 RT-PCR扩增目的基因cDNA 6 2.2.3 小麦基因组DNA提取、酶切及电泳分析 6 2.2.4 质粒DNA提取 6 2.2.5 质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 7 2.2.6 质粒载体和外源DNA的连接反应 7 2.2.7感受态细胞的制备及转化 7 2.2.8地高辛标记的Southern杂交 7 2.3 实验器材 8 2.3.1RNA分离与纯化 8 2.3.2 RT-PCR扩增目的基因cDNA 8 2.3.3 小麦基因组DNA提取、酶切及电泳分析 9 2.3.4 质粒DNA提取 9 2.3.5 质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 9 2.3.6 质粒载体和外源DNA的连接反应 9 2.3.7感受态细胞的制备及转化 9 2.3.8地高辛标记的Southern 9 2.4 实验步骤 10 2.5实验结果 10 2.6 分析讨论 13 3.总结 14 4.参考文献 15 5.附 录 16 围绕Southern杂交的系列分子实验 作者：姚国财 指导老师：潘君风 摘 要Southern杂交实验是本次分子生物学实验的核心环节，贯穿整个分子实验。实验报告将从获取不同的目的基因（小麦cDNA，小麦全基因组，小麦PCR基因组，小麦全基因组酶切产物，大肠杆菌质粒及其质粒PCR，质粒酶切产物等），凝胶电泳分离DNA转移到NC膜上，与标记的DNA探针杂交这三个方面将本次分子实验整理汇总成本篇实验报告。 关键词：southern杂交；DNA提取；PCR扩增；凝胶电泳 1.前言：（略） 2.实验 2.1 实验材料 暗培养7天的小麦幼苗（黄化苗），含质粒的大肠杆菌P38 2.2 试剂 2.2.1RNA分离与纯化 Trizol Reagent（Trizol试剂盒） 氯仿，异丙醇，70%乙醇，DEPC(含有RNA灭活酶)处理的ddH2O，溴乙锭（EB）10mg/ml，点样缓冲液Loading buffer(10×)（0.25%溴酚蓝，40%甘油）。 2.2.2 RT-PCR扩增目的基因cDNA RNA模板，cDNA引物，反转录缓冲液，dNTP，MMLV反转录酶，RNA抑制剂（RNasin），Taq酶及PCR缓冲液（10×），引物（P1、P2）。 2.2.3 小麦基因组DNA提取、酶切及电泳分析 DNA抽提液（CT-AB） 用时将下述三种溶液按1:1:0.4 (V/V)比例混匀，加入亚硫酸氢钠（3.8g/L），即为抽提液。 ① DNA extraction（500ml）： 31.885g sorbitol(山梨醇) 6.05g Tris pH8.2(一般不调) ② Nuclei lysis buffer（500ml）: 100ml 1M Tris pH7.5 100ml 0.25M EDTA 200ml 5M NaCl 10g CTAB 100ml ddH2O ③5OOml 5% sarkosyl (N-月桂酰肌氨基钠盐) 氯仿：异戊醇（24：1） 70%乙醇 异丙醇 HindIII酶 EcoRⅠ酶 2.2.4 质粒DNA提取 质粒小提试剂盒（天安公司，中国产） LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，溶解于1000mL蒸馏水中，用NaOH调pH至7.0。高压灭菌20分钟。 LB平板培养基：在每1000mL LB液体培养基中中加入15g琼脂，高压灭菌20分钟。 溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，10mmol/LEDTA，25mmol/L Tris-Hcl(pH8.0),冰箱保存，RNA酶要提前加入溶液Ⅰ中； 溶液Ⅱ：0.2mol/L NaOH,1%SDS（碱性的NaOH使蛋白质变性，SDS结合变性的蛋白质）； 溶液Ⅲ：Ph4.8的醋酸钾溶液（5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml,水28.5ml）λDNA TBE缓冲液（5×）：用时需稀释10倍 点样缓冲液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油 溴乙啶(EB)：10mg/ml溴乙啶 （注意：该试剂具致癌