目的基因的克隆表达【参考】.docVIP

目的基因的克隆表达 一．PCR 1.原理 DNA在高温时发生解链，温度降低时又可复性成双链。根据DNA的半保留复制原则，通过控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶，dNTP完成特定基因的体外复制。 2. 反应体系 LA Taq DNA聚合酶 0.25*6=1.5ul 10* buffer 2.5*6=15 ul dNTP 4*6=24 ul P1 1*6=6 ul P2 1*6=6 ul 模板 1*5=5 ul 水 15.25*6=92 ul 3. 注意事项：先加多的再加少的；模板最后加；设置阴性对照，不加模板，加入等量的水 4.反应过程 （1）预变性：94℃,1min (2)变性：90℃,30s (3)退火：45-60℃，45 s （4）延伸:72℃,2min (5)2,3,4,5步循环 （6）72℃,10min （7）16℃，保温 二．琼脂糖凝胶电泳 1.原理：若将一种分子置于电场中，它会以一定的速度向适当的电极移动。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。由于琼脂糖凝胶是一种无反应活性的稳定的支持介质，故电泳的迁移率与分子的摩擦系数成反比。已知摩擦系数是分子大小，极性及介质粘度的函数。因此，根据分子大小的不同，构型或形状的差异以及所带的净电荷的多寡，便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。在凝胶电泳中，加入适量的溴乙啶或Glodview染料，它能对核酸分子进行染色，而不与琼脂糖凝胶相结合，然后将电泳标本放在紫外线下观察，可清晰地检测到发出绿色荧光的DNA谱带位置。 2.具体操作 1.制胶 （1） 称量0.25g琼脂糖和25ml缓冲液TBE，混合均匀 （缓冲液TBE的作用：用于稳定体系酸碱度，使溶液两极的PH保持基本不变；是溶液具有一定的导电性，利于DNA的迁移） （2） 在微波炉中打化，每20s摇一下 （3） 按每10ml培养基加0.5 ul的比例加入Glodview核酸染料，使DNA带上绿色荧光标记 （4）倒入制胶板中冷却 2.点样 将loading buffer和基因按1:5混匀，加入凝胶孔中 （loading buffer的作用：指示作用；沉淀样品，使DNA粘度增大，以防跑散） 3.电泳 电压81V,电流46mA，时间25min 4.拍照 5.胶回收 （1）将要回收的样本在回收胶中进行电泳 （2）利用紫外分析仪进行切胶，注意避免样本经紫外照射时间太长而发生突变 (3) 加入buffer DE-A,混匀后于75℃加热，使胶融化 （4）加入buffer DE-B,保证形成均一的黄色溶液 （5）吸取混合液转移至DNA制备管，12000rpm离心1min,弃上清 （6）将制备管置回2ml离心管，加500ul buffer W1, 12000rpm离心30s,弃滤液。以同样的方法再用700ul buffer W2, 12000rpm离心1min （buffer W1的作用：洗涤；buffer W2的作用：冲洗，确保清除盐分，消除对酶切反应的影响） （7）将制备管置于1.5 ml离心管，在制备膜中央加入25-30ulEluent或去离子水，室温静置1min，12000rpm离心1min，洗脱DNA 八．重组质粒的构建（连接） (1)10ul体系 T载 1ul Rvo188(质粒) 4ul Solution 1 5ul (2)16℃保温过夜 （3）T载的特点 1.含氨苄抗性基因 2.含lacZ基因，编码半乳糖苷酶N端146个氨基酸 3.容易与目的基因连接 九．蓝白斑筛选（转化至JM109） 转化原理：菌株经低温预处理后，再转移到42℃环境中，造成细胞膨胀，细胞膜的通透性改变，极易与外源DNA相黏附并在细胞表面形成复合物，最后被细胞吸收的可能性增大。 （1）提前登记使用超净 （2）点酒精灯，消毒（手，台面） （3）10ulT载加入JM109菌液中，并设置阴性对照加入10ul水 （4）放入冰中30min以降温 （5）在42℃水浴锅中热激75s，使重组基因转化至JM109中 （6）放入冰中2min （7）加入900ulLB培养基，进行复苏 （8）封口后，摇床培养2.5-3h （9）培养基与IPIG诱导剂 1:1 Amp(50mg/ml) 1:2 x-gal(20mg/ml) 1:2 混合均匀后，倒平板 （10）6000rpm离心5min,弃去900ul上层液