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免疫胶体金技术 Immune colloidal gold technique 胶体金标记技术的相关定义 胶体金技术的发展Development of Immune colloidal gold technique 1939-----雏形 Kausche等把烟草花叶病毒吸附到金颗粒上在电子显微镜下观察金离子呈高电子密度。 1971------作为标记物应用于免疫组织化学研究 Faulk等首先将兔抗沙门菌抗血清与胶体金颗粒结合，用直接免疫细胞化学技术检测沙门菌的表面抗原。 1974------实现间接免疫金染色法 Romano将胶体金标记到马抗人的IgG上，实现了间接免疫金染色法 胶体金技术的种类及优点 快速免疫金渗滤法(immuogold filtration assay ,IGFA) 即穿流式(flow through)的固相膜免疫测定。 主要由两部分组成：膜渗滤装置和标记结合物。前者为一塑料小盒，其中填满吸水性物质，面上紧贴放置一片吸附有抗体(以双抗体夹心法测抗原为例)的硝酸纤维膜，标记结合物为免疫金。 免疫胶体金技术的特点 优点： 检测方法简单而快速，数分钟即可得出结果； 不需仪器设备，操作人员不需特殊训练； 试剂稳定，适用于单份测定； 无污染。 GICA的特点是单一试剂，一步操作。小型实验室即有条件开发生产。 干燥包装的试剂可在室温保存一年以上。?? 最近由于原料的精选和制作工艺的改进，已能制备出可用于定量测定的GICA试剂。Roche公司生产的用于急性心肌梗死诊断的肌钙蛋白和肌红蛋白的GICA试剂和匹配的简便测读器Cardiac Reader，其精密度和准确性均符合定量测定要求。 胶体金合成 溶液颜色随金颗粒的大小广泛的变化。通常为深红色。但是也有深棕色/紫色至浅橙色/黄色。 胶体的大小由金来控制：柠檬酸盐的比率大约在1到100nm。（？） 柠檬酸盐很容易被亲金物质所取代(例如：硫醇) 胶体金合成程序 将100ml的0.1％H2AuCl4加入200ml的锥形瓶中，并将其置于搅拌电热炉上，加入一个磁力条并将溶液加热至沸腾。 向沸腾的溶液中加入1.5ml的0.1％二合水柠檬酸三钠，Na3C6H5O7.2H2O 当获得深红颜色的溶液时停止加热 不同大小的颗粒的合成与性质 胶体金颗粒的TEM图像 抗体如何被标记于金上 抗体结合于金上取决于三种独立且起独立而又相互依存的力： a在带负电荷的金粒子和带正电的蛋白质间的离子引力。 B抗体和金表面的疏水力 C巯基(-SH)的影响(半胱氨酸和蛋氨酸） 最强的引力可能源于硫键将抗体Fc 段的两个区域进行的连接。 金标样本程序 将胶体金调整至正确的pH值 确定最小蛋白含量 最终结合（标记） 纯化 为胶体金调整正确的pH值 胶体金与蛋白质的结合成功与否，取决于pH值，一般只有在蛋白质等电点(PI)略偏碱的条件下二者才能牢固地结合，因此，标记之前须将胶体金溶液的pH值调至待标记蛋白质的等电点略偏碱。 需要提高胶体金的pH值时可用0.1molK2CO3，需要降低胶体金的pH值时可用0.1N HCl。测定金溶液的pH可能损害pH测定计的探头，因此，一般用精密的pH试纸测定其pH即可. 蛋白 与胶体金结合的最佳pH测定 取若干1.5ml的试管，分别加入1ml胶体金 用K2CO3将pH分别调为3，4，5，6，7，8，9，10； 去96孔培养板，按pH从高到低分别将上述胶体金分别取100ul加入孔中，重复三次； 每孔分别加入20ul浓度为10%的NaCl溶液，混合，室温下放置10min； 观察胶体金颜色变化，记录保持红色的最低pH 为胶体金调整正确的pH值 常用几种蛋白质标记时胶体金所用的pH值 最小蛋白用量的确定 （1）光电比色法：制备一系列不同浓度的等体积蛋白质溶液（1ml），分别加入5ml胶体金中，迅速混匀，然后，各加入1ml 10% NaCl溶液，摇匀，静置5min后测各管。根据胶体金颗粒的大小，OD在520～580nm之间测定，以OD值为纵坐标，蛋白质用量为横坐标作一曲线，取曲线最先与横轴相接近的那一点处的蛋白质用量为最适稳定量。图5.2中10nm的胶体金溶液中蛋白质的最适稳定量为45μg/ml。 （2）目测法：以目测法确定胶体金与待标记蛋白质用量比例，将标记的蛋白质逐级稀释后（由5μg～45μg另设对照管），各取等体积顺序加入一系列装有1ml胶体金的试管中，5min后，在上述各管内分别加入0.1ml