蛋白质分离纯化及定综合实验.docVIP

蛋白质分离纯化及鉴定综合实验 一、实验内容 将昆虫总蛋白通过匀浆的方法溶解于磷酸氢二纳/磷酸二氢纳缓冲液中，离心取上清液作为蛋白质粗提液 用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质浓度； 将粗提液通过Sephadex G-25凝胶层析柱进行分离，分部收集流出物，得到不同的组分，测定不同组分的蛋白质浓度； 将蛋白粗提液和收集到的各组分进行SDS—PAGE分析，比较粗提液和各组分中蛋白质的成分，分析分离效果。 二、实验过程： 1.蛋白质粗提液制备 溶液配制：0.1mol/L pH7.4 磷酸缓冲液 （1）1000ml 0.1mol/L磷酸氢二纳； 磷酸氢二纳溶于800mL蒸馏水中，定容至1L； （2）250mL 2.蛋白质浓度测定 （1）溶液配制 1mg/mL 牛血清白蛋白（BSA）标准溶液：5mg牛血清白蛋白溶于5ml水中； 考马斯亮蓝G-250蛋白试剂：称取100mg考马斯亮蓝G250溶于50ml 90%的乙醇溶液中，加入85%的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL，滤纸过滤，避光保存。 （2）0~100ug/mL标准曲线测定： 取6支试管，按下表配制蛋白质浓度梯度各2mL 蛋白质浓度μg/ml 0 20 40 60 80 100 1mg/mL BSA溶液（μl） 0 40 80 120 160 200 蒸馏水（μl） 200