专题五DNA的粗提取与鉴定课程.ppt

* §5.1 DNA的粗提取与鉴定 一、基础知识 （一）提取DNA的方法 1.提取生物大分子的基本思路 选用一定的物理或化学方法，分离具有不同物理或化学性质的生物大分子 2.提取DNA的基本思路 提取DNA，去除其他成分 利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等 在物理和化学性质方面的差异 ⑴ DNA的溶解性 DNA和蛋白质等成分 在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同 利用这一特点， 选择适当的盐浓度 就能使DNA充分溶解， 而使杂质沉淀； 或者让其他成分溶解， DNA析出 3.DNA等大分子的理化性质 ⑵ DNA不溶于酒精溶液 ⑶ DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性 DNA不溶于酒精溶液， 但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。 将DNA与蛋白质进一步分离。 ⑵ DNA不溶于酒精溶液 ⑶ DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性 ① 蛋白酶——水解蛋白质， 对DNA没有影响 ② 高 温——大多数蛋白质不能忍受60～80℃ 而DNA在80℃以上才会变性 ③ 洗涤剂——溶解细胞膜，去除脂质和蛋白质 但对DNA没有影响 试剂： （二）DNA的鉴定 条件： 二苯胺 沸水浴条件下，DNA遇二苯胺被染成蓝色 沸水浴 现象： （一）实验材料的选取 （二）破碎细胞，获取含DNA的滤液 （三）除去滤液中的杂质(纯化) （四） DNA的析出与鉴定 二、实验设计 （一）实验材料的选取 从下列材料中选取2～3种 原则： 菜花、香蕉、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜； 鱼卵、猪肝、鸡血、哺乳动物的红细胞； 在液体培养基中培养的大肠杆菌 凡是含有DNA的生物材料都可以考虑 选用DNA含量相对较高的组织 从核DNA数目来看，猪38条，鸡78条，哺乳动物血0条，猕猴桃58条，洋葱16条，豌豆14条，菠菜12条，大肠杆菌1条。请选择动植物材料各一种。 哺乳动物的血细胞无细胞核及细胞器。 液体培养基中的大肠杆菌的DNA量减少。 鱼卵是减数分裂的产物。 （二）破碎细胞，获取含DNA的滤液 1、动物细胞 2、植物细胞 ——容易破碎 ——需要溶解细胞膜 鸡血细胞溶液： 加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液 想一想：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？ 蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体， 水分大量进入血细胞，使血细胞胀裂； 加上搅拌作用，加速鸡血细胞细胞膜、核膜破裂，从而释放出DNA ① 加入一定的洗涤剂和食盐 ② 充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液 想一想：洗涤剂和食盐的作用分别是什么？ 洗涤剂——离子去污剂，能溶解细胞膜，利于DNA释放 食 盐——NaCl，利于DNA的溶解于研磨液中 经研磨可破碎细胞壁，使细胞核内的DNA释放。若研磨不充分，会使提取的DNA量变少，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。 为了纯化提取的DNA需要将滤液作进一步处理 讨论：滤液/研磨液中可能含有哪些成分？ 答：可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质 想一想：研磨的目的是什么，如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？ 1. DNA的溶解性 2. DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性 （三）除去滤液中的杂质 讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？ 方案二：利用蛋白酶分解杂质蛋白，使提取的DNA 与蛋白质分开； 方案三：利用DNA和蛋白质对高温耐受性的不同， 使蛋白质变性，与DNA分离 （四） DNA的析出与鉴定 与滤液体积相等的冷却的酒精溶液(体积分数95％)， 静置2－3min，溶液中会出现白色丝状物 ——粗提取DNA 用玻璃棒沿一个方向搅拌， 卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水 1、DNA的析出 2. DNA的鉴定 ⑴ 向两支试管中分别加入 2mol/L NaCl 溶液5ml ⑵ 其中一支试管中加入DNA丝状物 ⑶ 各加入二苯胺试剂4ml ⑷ 混匀后，置于沸水浴中加热5min ⑸ 待冷却后，比较两只试管中溶液的颜色变化 观察现象： 溶解丝状物的溶液变为蓝色 方法步骤 加入物质 目的 1 . 制备鸡血细胞液 柠檬酸钠溶液 ① 2 . 提取鸡血细胞细胞核物质 20 m1 蒸馏水 ②幻灯片 18 3 . 溶解细胞核内的 DNA 2 m1 ／ L 的 NaCI 溶液 40 mL ③幻灯片 18 4 . 析出含 DNA 的黏稠物 蒸馏水 ④ 5 . 滤取含 DNA 的黏稠物 ⑤ 6 . 将 DNA 的黏稠物再溶解 2 mol ／ L 的 NaCl 溶液 20 mL ⑥ 7 . 过滤含 DNA 的 NaC l 溶液