革兰氏染色解决方案.ppt

革兰染色 一、染色标本的制备 1、涂片：载玻片上滴加生理盐水一滴，接种环取待检菌培养物少许，研入无菌生理盐水中，形成一个极薄的均匀的菌膜，直径在1cm左右为宜。如果时液体培养物则直接取少许菌液涂成菌膜。 2、干燥：室温自然干燥即可。也可在远离火焰上方的空气中干燥。切记不可太近火焰，以免烤焦废弃。 3、固定：一般用加热法固定。将载玻片迅速来回通过火焰3次，以玻片触及皮肤热而不烫为度。这样可以使菌体粘附于载玻片上。加热还可杀死细菌，改变细菌细胞膜的通透性，易于染色。也可用甲醇、乙醇等化学药品固定。 二、染色的目的与原理 细菌、真菌和其他微生物的细胞质是透明的，不借助染色方法很难观察到这些微生物。染色后有助于细菌的观察与菌种的鉴别。 细菌细胞通常带负电荷,简单染色时采用已知的、带正电荷的碱性染料与菌体细胞黏附使菌体着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明对比，更清楚易辨。 三、染色方法 1、单染色法：仅用一种染料对细菌进行染色，操作简单。可观察细菌的形态、大小及排列，但不能显示细菌的结构及染色特性。分为染色、水洗、干燥三个步骤。染色剂为亚甲蓝或碱性复红染色液。 三、染色方法 2、复染色法：用两种或以上的碱性染料先后对细菌进行染色。可观察细菌的形态、大小及排列，能显示细菌的结构及染色特性，还有鉴别细菌的作用。常用革兰染色法。通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰阳性菌（G+）和革兰阴性菌（G-）两大类。丹麦细菌学家G.Gram发明而得名。 2.1实验材料：大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌18-24h培养物；草酸铵结晶紫染液；沙黄染液；生理盐水；95%乙醇；卢戈碘液；二甲苯；接种环；酒精灯；显微镜等。 2.2、染色方法：包括初染、媒染、脱色、复染、镜检、结果分析等步骤。 初染染料为碱性染料，常用结晶紫。 媒染剂的作用是增强染料与细菌的亲和力，更好地加强染料与细胞的结合。常用碘液。 脱色剂帮助染料从被染色的细胞中脱色。利用细菌对染料脱色的难易程度不同，而将细菌加以区分。革兰阳性细菌不易被脱色剂脱色，而革兰阴性细菌则易被脱色。常用丙酮或乙醇。 复染液也是一种碱性染料，目的是使脱色的细菌重新染上另一种颜色，以便与未脱色菌进行比较。常用沙黄染液或蕃红花红溶液 2.3、意义： （1）鉴别细菌:用此染色法可将所有细菌分为两大类,这样可将致病菌的范围缩小,然后再进一步鉴定。 (2)选择药物:革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌在细胞壁等结构上有很大差别,因而对抗生素的敏感性不同。例如大多数阳性菌对青霉素敏感大多数阴性菌对青霉素不敏感(脑膜炎球菌等除外),可供临床实践中选用抗菌药物的参考。 (3)与致病性的关系:大多数革兰氏阳性菌的致病物质主要为外毒素;而大多数革兰氏阴性菌的致病物质主要为内毒素. 2.4具体操作步骤： 2.4.1涂片：左手持菌液试管，右手持接种环，用接种环从试管培养液中取一环菌，从酒精灯外焰穿过，于载玻片中央涂成薄层（事先在背面做好标记圆圈）即可，或先滴一小滴无菌水于载玻片中央，用接种环从斜面上挑出少许，与载玻片上的水滴混合均匀，涂成一薄层。拔或塞试管塞时，应将试管口通过火焰略加烧灼，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。 具体操作步骤： 2.4.2干燥：涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥，但勿靠近火焰。 2.4.3固定：常用高温进行固定。即手持载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速来回移动3~4次，共约3~4秒。要求玻片温度不超过60℃，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜，放置待冷后染色。 具体操作步骤： 2.4.4. 染色： （1）初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。 （2）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。 （3）脱色：将载玻片上的水甩净，并衬以白背景，用95%酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20—30秒，立即用水冲净酒精。 （4）复染：用番红液染1—2分钟，水洗。 （5） 镜检：干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性 （6） 同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。 2.5固定的目的 ① 杀死微生物，固定其细胞结构； ② 保证菌体能牢固地粘附在载玻片上，以免水洗时被水冲掉； ③ 改变菌体对染料的通透性，一般死细胞原生质容易着色。 2.6实验现象： 染色后菌体呈蓝紫色的，称为“革兰阳性菌”；菌体是伊红色，称“革兰阴性菌”。无论阳性菌还是阴性菌，都有杆菌和球菌。葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌是临床最为常见的病原菌。葡萄球菌属于革兰阳性菌，大肠杆菌属于革兰阴性菌。除大肠杆菌以外，临床较常见的肠杆菌科细菌还有变形杆菌属，沙门菌属、克霉白菌属；铜绿假单胞菌是临床常见的较耐药革兰阴性