基因克隆的技术路线辩析.pptVIP

* 实验操作： 1）RNA提取 2）RNA电泳（分离不同长度RNA) 3）转膜 (形成固相RNA) 4）探针标记（同位素/非同位素） 5）杂交 6）洗膜 7）显影（放射性/酶促反应） * Northern blot 特点： 因为没有扩增过程，Northern blot 的 结果可靠性高。可以确定未知基因的 转录产物（mRNA）长度。 优点： 缺点： 1、操作烦琐 2、使用同位素可能污染环境 3、灵敏度低 4、对RNA质量要求高 * 3、Western blot 标记抗体与固定在膜上的蛋白作用。 根据信号强弱判断蛋白表达强度。 根据信号位置判断蛋白分子量。 标准分子量 蛋白 特异性反应带 * 1）蛋白提取 2）蛋白电泳（分离不同分子量蛋白） 3）转移 4）封闭 5）一抗作用 6）标记二抗（HRP/AP标记）作用 7）显色 实验操作： * Western blot 特点： 优点： 直接检测蛋白质的表达量。 缺点： 灵敏度低 一抗制备难度大，购买价格高 * 氨基酸序列测定 测定N端的10－15个氨基酸 测定C端的5个氨基酸 样品需精制 价格较高 * * Direct selection 直接筛选 Antibotic resistance 抗菌素抗性 Marker rescue selection 借助