何水林版基因工程第四章 基因操作过程(教学版).ppt

第四章　基因操作过程　 如何选择最合适的DNA聚合酶 －－ PCR 实验的不同需求 特 异 性：基因组扩增、RT-PCR 保 真 性：基因筛选、测序、 TA克隆 长片段扩增：构建基因图谱、测序、分子遗传学 扩增效率：复杂模板扩增（GC含量高、二级结构） PCR试剂盒：复杂模板扩增、大规模基因检测 Ⅱ简并引物设计（degenerate primers) 非特异性扩增 现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带 拖尾 现象：产物在凝胶上呈Smear状态 假阳性 现象：空白对照出现目的扩增产物 原因：靶序列或扩增产物的交叉污染 对策： 操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外 除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。 各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。 同源性比较 /blast/blast.cgi 中在线比较 采用OMIGA，PGCENE进行两两比较或多序列比较 3.2　PCR技术基本原理和操作 类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物 基本反应步骤 变性 退火 延伸 变性 3.2.1　PCR技术基本原理 ①　模板DNA的变性 　　模板DNA经加 热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双