5-3课题3血红蛋白的提取和分离概要.ppt

【目标导航】　1.知道凝胶色谱法、电泳法等分离生物大分子技术的基本原理。2.掌握血红蛋白提取和分离的基本过程。 一、 血红蛋白提取和分离的基本原理 1．凝胶色谱法 (1)概念 也称做 ，是根据 的大小分离蛋 白质的有效方法。 (2)原理 ①由 构成的凝胶，内部有许多贯穿的 。 ②当 不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质 量 的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程 ，移 动速度 ，而相对分子质量 的蛋白质无法进入凝胶 内部的通道，只能在 移动，路程 ，移动速度 ，从而使相对分子质量不同的蛋白质分子得以 。 2．缓冲溶液 (1)作用 在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的 对 溶液pH的影响，维持pH 。 (2)配制 由1～2种 溶解于水中配制而成，通过 就可以得到在不同pH范围内使用 的缓冲液。 3．电泳 (1)概念 指 在电场的作用下发生 的过程。 (2)原理 在一定的 下。多肽、核酸等生物大分子的可解离基团 会带上 或 ，在电场的作用下，这些带电分子会 向着 的电极移动。 (3)作用 电泳利用了待分离样品中各种分子 的差异及分子本 身的 、 的不同，使带电分子产生不同的 ， 从而实现样品中 。 (4)方法 常用的电泳方法有 和 。 测定蛋白质分子量时通常使用 。 二、 血红蛋白提取和分离的实验操作与评价 1．蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理、 、纯化和 。 2．样品处理 (1)红细胞的洗涤 采集血样， 短时间离心，吸取血浆后加 洗 涤，再低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清 液中没有黄色。目的是 ，以利于后续步骤的分 离纯化。 (2)血红蛋白的释放 将洗涤好的红细胞依次加入 至原血液体积、40%体 积的 ，置于磁力搅拌器上搅拌10 min，使红细胞吸水 ，血红蛋白释放出来。 (3)分离血红蛋白溶液 将搅拌好的混合液转移到 中，以2 000 r/min的速度 10 min。使血红蛋白和其他杂质分离开，便于下一 步对血红蛋白的纯化。 (4)透析 取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的 中(pH为 7.0)，透析12 h(以除去样品中相对分子质量较小的杂质)。 3．凝胶色谱操作 (1)凝胶色谱柱的制作：准备材料→加工橡皮塞→安 装 。 (2)凝胶色谱柱的装填。 (3)样品的 。 4．操作提示 (1)红细胞的洗涤 、 与 十分重要。洗涤次数过 少，无法除去 ；离心速度 和时间 会使 等一同沉淀，达不到分离效果。 (2)色谱柱填料的处理 商品凝胶使用前需直接放在 中膨胀，可以将加入 其中的湿凝胶用 ，加速膨胀。 (3)凝胶色谱柱的装填 在装填凝胶柱时，不得