CD34绝对计数概要.pptVIP

* * 河南省人民医院血研所 * (5)CD45/CD34。显示R1门内细胞，设定CD45和CD34阳性十字界线，确定R1的左边界CD45下限。 (6)FS/SS。显示R5门内细胞，用于确定R4的FS下限。 双平台ISHAGE设门 河南省人民医院血研所 * 单平台ISHAGE设门法 商业化的CD34+细胞绝对计数试剂盒,其CD34+细胞绝对数由专门软件直接计算生成，操作依据是试剂操作说明书。实验室自己配制的抗体组合需要加入商业化荧光微球。 河南省人民医院血研所 * 河南省人民医院血研所 * 同双平台相比，单平台多设了R6（荧光微球）、R7（细胞碎片）及R8（活的CD34+细胞）。 单平台ISHAGE设门 河南省人民医院血研所 * 单平台ISHAGE设门法 需手动设门，对操作者要求高；无需同型对照，亦不受抗体浓度及荧光素与蛋白比率的限制，经济廉价，抗体的选择范围也宽；7-AAD活细胞染料，可计数活细胞，需逻辑手动设门。 河南省人民医院血研所 * 结果报告和审核 河南省人民医院血研所 * 报告内容 双平台ISHAGE法报告CD34+ 细胞百分比及绝对值； 单平台ISHAGE法报告CD45+ 细胞绝对值、CD34+细胞百分比 及绝对值、活CD45+细胞和 CD34+细胞绝对数。 河南省人民医院血研所 * 审核内容 包括数据采集阈值的设置、采集细胞数和微粒数、散射光模式、抗体组合方案、与实验结果相关的所有设门等。这些数据均由实验室专业人员在解释数据时进行审核。 河南省人民医院血研所 * 参考范围 每个实验室都应确定本实验室CD34+细胞在外周血、动员后的外周血、采集物、骨髓和脐带血中的参考范围。 河南省人民医院血研所 * 数据储存 数据储存和检测数据的方法都应详细记录，以便于检测者或医师对数据进行复核。保留报告原始数据至少2年。 河南省人民医院血研所 * 室内质控 实验室应开展室内控制工作，建议每月至少进行室内质控一次。进行室内质控品检测前，首先采用健康志愿者的新鲜外周血标本作为质控物上机测定，一般需要做重复测定。 河南省人民医院血研所 * 室间质控 实验室应参加国内或国外质评机构组织的室间质量评价和能力验证，用于能力验证的样本需与病人标本同等对待，要求检验人员和检验流程完全一致。 河南省人民医院血研所 * 人员培训 流式细胞分析室应具有监督人员和操作人员岗位，并制定用于培训的标准化操作规程。实验室监督人员对每一位操作人员的培训效果、流式细胞术检测能力进行考核并决定是否授权上岗。 河南省人民医院血研所 * 小结 应用流式细胞CD34+细胞计数是一个已被普遍接受的快速、简便的方法； 河南省人民医院血研所 * 小结 不同流式细胞术CD34+计数各有 优缺点，所得结果有一定的差别； 单平台ISHAGE法重复性好，室 间差异小，但技术要求高。 河南省人民医院血研所 * * * * * * * * * * * * * * * * * 河南省人民医院血研所 * 为避免荧光微球的丢失，单平台计数在裂解红细胞后不用离心洗涤。 离心 河南省人民医院血研所 * 双平台方法 双平台：分别用FCM检测出CD34+细胞在有核细胞中的比例，用血液细胞计数仪检测出有核细胞浓度，在光镜下进行白细胞分类，然后再计算出采集物中CD34+细胞总数。 河南省人民医院血研所 * 双平台方法 白细胞浓度与抗体用量同单平台方法，不需要采用已知数量的荧光微球管或加入荧光微球悬液。裂解红细胞的时间和方法按照所用溶血素说明书进行，裂解红细胞后进行离心洗涤2次。 河南省人民医院血研所 * 免疫荧光染色 可采用商品化CD34+细胞计数试剂盒或实验室自己组合的单抗。 河南省人民医院血研所 * 免疫荧光染色 自己组合的抗体中,每一种抗体都需分别滴定,以明确其噪音与阳性信号的最佳分离滴度，并检测作为组合抗体使用和作为组合抗体成分之一单独使用的平均荧光强度和阳性率，其可比性需要在均值±2标准差之内。 河南省人民医院血研所 * 抗体及荧光微球的选择 CD34抗体：选择PE直标的抗Ⅲ类抗体； CD45抗体：选择广谱的抗CD45抗体； CD34抗体同型对照：采用与CD34匹配的同一 厂家生产的同型对照； 定量荧光微球：推荐使用绝对计数的商品化荧光微球。 河南省人民医院血研所 * 抗体组合方案 含7-氨基放线菌素D（AAD）的三色方案：抗体组合为CD45，CD34，7-AAD； 不含7-AAD的双色方案：抗体组合为CD45，CD34。 河南省人民医院血研所 * 免疫荧光染色 按照试剂说明书和注意事项进行操作，一般流程如下： 河