酪氨酸酶的提取及其酶促反应动力学学案.ppt

酪氨酸酶的提取及其酶促反应动力学研究 一、实验目的 1.认识生物体中酶的存在，了解生物体系中酶促反应的特点； 2.了解底物浓度对酶促反应速度的影响； 3.了解抑制剂对酶促反应速度的影响； 4.掌握用双倒数作图法求米氏常数； 5.实验拟通过从土豆等物中提取酪氨酸酶并就其酶促反应的动力学研究其活性。 二、实验原理 影响酶促反应速度的因素： 酶的浓度[E]　 底物的浓度[S] 溶液的pH值 温度 酶的抑制剂 酶的激活剂 酶催化剂的特点 1.具有表观活性和专一性所需要的结构空间，反应能在比较温和的条件下进行； 2.酶促反应的活化能较低； 3.酶的催化效能极高； 4.酶具有高度的专一性。 一、底物浓度对酶促反应的影响 随反应物浓度S的增大，酶促反应速度V增大。当底物的浓度较低时，V随〔S〕增大而急剧增大，二者成正比关系；随着〔S〕的继续增大，V继续增大，而增幅逐渐减小，若再继续增大〔S〕，则V将不再变化， 达到一个极 限值Vmax。 酪氨酸酶对多巴的催化氧化原理 影响酶作用的因素：酶的浓度、底物浓度、溶液的pH值、和酶抑制剂等。 　　　　　　　　　　　　　米氏方程 [S]、[E]分别为底物浓度和酶的浓度，km为米氏常数，其物理意义是当酶促反应速度到达最大速度一半时的底物浓度，单位mol/L 对米氏方程进行双倒数得到： 以1/v为纵坐标，1/[S]为横坐标作图，由图得到截距和斜率，即可计算vmax和Km。 仪器与试剂 仪器：分光光度计　植物组织捣碎机　离心　　　　　机　恒温水浴 试剂：pH6.8磷酸盐缓冲溶液　多巴溶液（200mg/L）　铜试剂（10-3mol/L） 土豆 实验步骤 1.络氨酸酶的提取：取75g的去皮土豆，切碎，置于植物组织捣碎机中，加入冷却的磷酸盐缓冲溶液150ml，在高速转速下捣碎2分钟，然后倒入干净烧杯中静置2分钟，去上层清液于离心式管中在3000r/min转速下离心分离5分钟。 2.Km和vmax的测定：在6支比色管中按表1加入缓冲溶液、多巴溶液，摇匀、30℃恒温10min，再在00、0、1号比色管各加入络氨酸酶提取液各0.20mL，摇匀后立即倒入比色皿中，以00号为参比溶液，测量其吸光度，前5min每隔30s测量一次溶液的吸光度，后5min每隔60s测量一次溶液的吸光度，并记录溶液的吸光度和对应反应时间。以同样方法测量2-5号溶液的吸光度并记录数据。 3.抑制剂的影响：按表2的所列的数据进行溶液的配制，以0号溶液为参比溶液，按步骤2的方法测量各个溶液的吸光度随时间的变化。 数据记录表1 数据记录表2 数据记录及处理 1.根据朗伯-比尔定律，将测得的吸光度计算转化为浓度，以浓度为纵坐标，时间为横坐标作图，求得直线的斜率即为反应的速度v； 2.根据双倒数米氏方程，以1/v为纵坐标，1/[S]为横坐标作图，求得直线的截距和斜率即可计算反应的最大速度vmax和米氏常数Km； 3.抑制剂的影响：求出未加入和加入抑制剂的反应速度，以反应速度为纵坐标，抑制剂浓度为横坐标作图，判断抑制剂对反应的影响。 实验注意事项 1.络氨酸酶的提去要现提现用； 2.提取时的温度不能太高； 3.反应温度的设置应低于40℃； 4.反应温度应保持恒定。 * * 0.2 2.5 2.3 4 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 酶提取物 3.0 2.0 1.5 1.0 1.0 0.0 多巴溶液 1.8 2.8 3.3 3.8 3.8 4.8 缓冲溶液 5 3 2 1 0 00 项目 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 酶提取物 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 铜试剂 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 0 多巴溶液 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 4.6 缓冲溶液 5 4 3 2 1 0 项目 时间 5 4 3 2 1 0吸光度 　浓度 时间 5 4 3 2 1吸光度 　浓度