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双向电泳实验教程 一、实验过程 1、蛋白质干粉的制备 可溶性蛋白提取法 1．于超低温冰箱中取样品取出水稻样品3g 2．放到研钵中，液氮研磨充分，移入50ml离心管中 11000rpm，15min，上清11000rpm，15min，上清min，弃上清 7．丙酮清洗3次然后真空抽干 8．按适当比例加入裂解缓冲液，室温超声溶解1~2h . 11000rpm，15min，取上清即为蛋白样品．样品放置于-20℃冰箱1．于超低温冰箱中取样品取出水稻样品3g 2．放到研钵中，液氮研磨充分，移入50ml离心管中 3．加入TCA抽取液20ml,震荡，-20℃沉淀过夜 4．11000rpm，15min，去上清 5．加入20ml-20℃预冷的冷丙酮（内含0.07%β-巯基乙醇）震荡，静置2h，然后11000rpm， 15min，去上清（一般重复3次，洗至沉淀白色或者不能变色为止） 6．沉淀放于冰盒中然后放到真空干燥箱中真空抽干 7．按适当比例加入裂解缓冲液，室温超声溶解1~2h 8. 11000rpm，15min，取上清即为蛋白样品（此步剩下的残渣可以先留着） 9．样品放置于-20℃冰箱/丙酮抽取液：25gTCA（10%），0.07%β-巯基乙醇定容于250ml丙酮中 苯酚提取法 1．于超低温冰箱中取样品取出水稻材料样品3g 2．放到研钵中，液氮研磨充分，移入50ml离心管中 3．加入蛋白提取液15ml,震荡使其混合均匀即可，于冰上放置30min 4．加入等体积的Tris平衡酚，震荡使其混合均匀，于冰上放置30min 5．11000rpm，4℃，,20min，收集上层酚层。 6. 用抽提液洗酚层2次 7.加入5倍体积的甲醇醋酸铵，沉淀静止过夜 8．11000rpm，4℃，,30min，去上清 9. 用洗液1洗涤沉淀，11000rpm，4℃，,30min，去上清 10．用洗液2洗涤沉淀，11000rpm，4℃，,30min，去上清 11．沉淀放于冰盒中然后放到真空干燥箱中真空抽干 12．按适当比例加入裂解缓冲液，室温超声溶解1~2h，溶解的样品即为蛋白样品 13,。将样品放置于-20℃冰箱中保存。 药品配方： 蛋白提取液 1%PVP，0.7M蔗糖，0.1M Kcl，0.5M Tris-Hcl，500Mm EDTA.2Na，1mM PMSF,2%β-Me 洗液1 80%丙酮（0.07%β-Me） 3．洗液2 100%丙酮（0.07%β-Me） 2、样品的溶解 取蛋白干粉10mg于1.5ml的离心管中，加入200－250ul裂解液（先加100-200ul左右，用小棒研磨后，再逐次加入余量裂解液牛血清白蛋白BSA)配成1mg/ml的溶液贮存于4℃冰箱 2)、设7个浓度梯度制作标准曲线，每个梯度设3个重复，依下表加入1mg/ml BSA、0.1M Hcl、ddH2O。(均使用10ml离心管) 管号 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 ddH2O(ul) 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1mg/ml BSA(ul) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0.1M Hcl 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 3)、每管加入5ml Bradford工作液595nm下595关系的标准曲线方程式：Y= aX+b.其中Y为 OD值，X为蛋白含量。 a、b相关系数通过输入数据，作图，软件分析可得Bradford工作液振荡,15000r离心5min除杂质，取上清。0℃取出后置室温下放置5min。向IPG胶条槽(strip holder)中加入0.45ml溶有样品的泡胀液后，再将IPG 胶条去掉保护膜，胶面向下放入胶条槽中，酸性端对应正极，碱性端对应负极；IPG等电聚焦仪(IPGphor)上，泡胀和等电聚焦的参数见表1。再水化及等电聚焦条件均设置为20℃，50uA/strip。 IEF 参数设置 steps 1 2 3 4 5 Voltage(v) 500 1000 8000(gradient) 8000 1000 Time(h) 1 6 3 4 30 S1、S2用于去小离子S3和S用于聚焦S5。(进行等电聚焦之前，先让泡胀液与胶条充分接触，一般过夜或者12h) *在进行IEF时，室温易保持在20-23℃之间为宜，以免IPGphor的电板出现冷凝水而可能导致的仪器短路事故。 5、胶条平衡 等电聚焦后，用镊子胶面，即接触样品那一面不能接触滤纸以正极端（即酸性端）向下，负极端（即碱性端）向上平衡时要注意保持胶面始终向上,不能接触平衡管壁。Image Scanner电泳扫描仪进行扫描，分辩率设置为300dpi(或600 dpi)、24位全彩