第03章显微镜案例分析.ppt

提高显微镜分辨率的最有效方法是采用短波长的照明光源 x射线和γ射线的波长都很短，但至今还无法使之有效地改变方向、折射和聚焦成像。1924年，德布罗意(De Broglie)发现电子波的波长比可见光的波长短十万倍；1926年，布什（Busch）指出轴对称非均匀磁场能使电子波聚焦。这些理论的出现，表明可以采用电子波作为显微镜的光源。在1933年鲁斯卡（Ruska）等人设计并制造了世界上第一台透射电子显微镜。 电子显微镜的照明光源是电子波。电子波的波长取决于加速电压和电子的质量 我们把静电场的等位面做成凸透镜形状，那么平行电子束也将会聚在一个焦点上。图7-3是静电透镜的示意图，其中U1U2，相应的电力线方向如图所示。在垂直于电力线的方向画出等位面，其形状与凸透镜相似。当平行的电子束从低向高入射时，就会在圆筒轴线的某一点上聚焦。 由于静电透镜需要很强的电场，常在镜筒内产生弧光放电和电击穿，低真空度情况下尤为严重。静电透镜焦距不能很短，因而不能很好地矫正球差。现在制造的透射电子显微镜，静电透镜仅用于使电子枪中的阴极发射出的电子会聚成很细的电子束，而不用来成像。 通电的短线圈就是一个简单的磁透镜，它能造成一种不均匀分布的磁场，结果使电子做如图7-4所示的圆锥螺旋近轴运动。一束平行于主轴的入射电子通过电磁透镜将最终会聚于轴线上一点（即焦点）。 三、倒 置 显 微 镜 倒置显微镜(Inverted Microscope)的组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。 倒置显微镜 四、暗视野显微镜 暗视野显微镜（dark field microscope）的聚光镜中央有档光片，使照明光线不直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至 4nm~200nm的微粒子，分辨率可比普通显微镜高50倍。 暗视野照明方式 五、偏 光 显 微 镜 偏光显微镜是利用光的偏振特性，对具有双折射性(即可以使一束入射光经折射后分成两束折射光)的晶体、液晶态物质进行观察和研究的重要光学仪器。 利用它可以清楚地观察到纤维丝、纺锤体、胶原、染色体、卵巢、骨骼、毛发、活细胞的结晶或液晶态的内含物、神经纤维、肌肉纤维、植物纤维等的细微结构，从而可以分析细胞、组织的变化过程。 五、偏 光 显 微 镜 偏光显微镜是在一般显微镜的基础上增添了使普通光转变成线偏振光和检测偏振光的装置或观察干涉图样的特殊透镜。即光源前有偏振片（起偏器），使进入显微镜的光线为偏振光，镜筒中有检偏器（一个偏振方向与起偏器垂直的起偏器）。 1.应用： TEM适于观察薄样品（厚度小于100nm)的显微和亚显微形态结构，观察薄晶体样本的衍射衬度像、晶格像以及测量微小物体的尺寸。 在生物医学中主要用于观察组织和细胞内的亚显微结构、蛋白质、核酸等大分子的形态结构及病毒的形态结构等。 区分细胞凋亡和细胞坏死。 细菌细胞结构、鞭毛结构、放线菌的孢子结构及孢子表面装饰物立体形状等超微结构的观察。 2.标本制备要求： 由于电子易散射或被物体吸收，故穿透力低，必须制备超薄切片（50nm-100nm)。 要在集体死亡后数分钟取材（不大于1mm3)用戊二醛和饿酸进行双重固定树脂包埋。切成超薄片后，经醋酸铀和柠檬酸铅进行电子染色。 4. ＴＥＭ的应用及标本的制备要求 5. 透射电子显微镜的优点 主要优点：分辨率高，可用来观察组织和细胞内部的超微结构以及微生物和生物大分子的全貎。 （二） 扫描电子显微镜（Scanning electron Microscope，SEM ） 1. 扫 描 电 镜 的 工 作 原 理 扫描电子显微镜的工作原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子由探测体收集，并在那里被闪烁器转变为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。 2. 扫 描 电 镜 的 结 构 二次电子探测器的工作原理图 3. 扫 描 电 镜 的 特 点 分辨率高(可达3nm) 3. 扫 描 电 镜 的 特 点 立体感强 3. 扫 描 电 镜 的 特 点 放大倍率范围广 (可放大十几倍到几十万倍) 脑细胞的实验小鼠 3. 扫 描 电 镜 的 特 点 样品适应性大 应用范围广 （三）扫 描 隧 道 显 微 镜（scanning tunneling microscope, STM） 样品台 探针 步进电机 双螺旋 测微头 1.扫描隧道显微镜的工作原理 扫描隧道显微镜是根据量子