RT-PCR为基础的T-RFLP应用于乳品发酵中新陈代谢活性细菌的半定量分析.docVIP

RT-PCR为基础的T-RFLP应用于乳品发酵中新陈代谢活性细菌的半定量分析 Jorge I. Sa′nchez a, Lia Rossetti b, Beatriz Mart?′nez a, Ana Rodr?′guez a, Giorgio Giraffa b,* a Instituto de Productos La′cteos de Asturias (IPLA-CSIC), ctra. Infiesto, s/n, 33300 Villaviciosa, Asturias, Spain b Istituto Sperimentale Lattiero Caseario, via A. Lombardo 11, 26900 Lodi, Italy Received 2 February 2005; received in revised form 21 July 2005; accepted 28 July 2005 Available online 21 September 2005 （杨明翻译） 摘要：一种包括RT-PCR扩增全部微生物群落的16S rRNA和T-RFLP的方法，对于在确定的乳酸乳球菌乳酸亚种和柠檬明串珠菌菌株培养中半定量的描述新陈代谢活性数量是最优的，这是两种在奶酪生产中被通常使用的嗜温的乳酸菌种。选择好的PCR引物高效地扩增这两个菌种的16S rRNA。用DdeI消化PCR产物生产每种菌种的不同的末端限制性酶切片段（T-RFs）。然而，由于嵌合分子的形成和来源于部分单链16S rRNA的扩增子的假T-RFs产生的额外的T-RFs在两个菌种中都被观察到了，尽管是很少量的。为了避免过量PCR产物对定量DNA产生的饱和效果导致的对总量的低估和尽量减少假片段的出现，20个PCR循环是最佳的。当应用于混合乳品培养时，T-RFLP分析表现出很好的可重复性。用这种方法和结果研究包括乳酸乳球菌乳酸亚种菌株和柠檬明串珠菌菌株的两种混合初始物的动力学，并和用纯培养获得的做对比。这些数据显示了用T-RFLP进行半定量微生物数量分析的适宜性。某些微小的差别可以用菌落计数不能被检测到的新陈代谢活性细胞的出现来解释。以RT-PCR为基础的T-RFLP可以作为传统方法之外的另外一种选择，用于研究相对简单的微生物（比如确定乳品起始物的培养物）生态系统的新陈代谢活性的群体动力学。 乳品初始物；RT-PCR；半定量；T-RFLP1．几种奶酪生产中常用的初始培养物通常包括成酸性的乳球菌，和一些通常属于乳酸乳球菌乳酸亚种、二丁酮链球菌和明串珠菌属某些种的利用柠檬酸盐的菌株。这些培养菌对于器官感觉的特征的发展是非常重要的（Ca′rcoba et al., 2000.）。确定的菌株的初始物已经被奶酪制造商日益增多地采用，作为一种尝试来解决与未受控制的自然发酵相关的问题。这对于奶酪的质量有积极的效果。因为整个发酵过程中菌株的平衡是一个关键点，所以需要监控任何对细菌群落结构的暂时影响，这些影响可能改变想得到的奶酪的特性的正确过程。（Giraffa, 2004） Fleet，1999）。 而且，在不利条件下，比如营养耗尽、低温和其他压力，某些微生物能进入可生存的但不可培养（VNC）VNC 状态的微生物仍然具有新陈代谢活性但是不能在通常支持它们生长的培养基上形成菌落，因此它们不能被传统的方法发现。为了克服这些问题，免培养法比如变性梯度凝胶电泳/温度梯度凝胶电泳（DGGE/TGGE）（SSCP）荧光原位杂交（FISH） PCR 为基础的技术比如长度异质 PCR（LH-PCR） 和末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）（Giraffa and Neviani,2001）（Osborn et al.,2000）。（T-RFs）PCR 的偏差可能对微生物群落真实组成的量化产生消极的影响（Suzuki and Giovannoni, 1996; Suzuki et al.,1998）（Bentsink et al.,2002; Wolffset al.,2005）。 DNA 为基础的 PCR 不能区分生活的、VNC 和死细胞，这就限制了它用于监控目的的使用 （Sheridanet al.,1998）（Van der Vliet et al.,1994）PCR（RT-PCR）（Bentsink et al.,2002）PCR 的偏差，这种方法被最优化并且检验了它的可重复性。 2．材料与方法 2.1 细菌菌株和生长条件 本研究中使用的细菌菌株包括从人工奶酪中分离的两株柠檬明串珠菌菌株（IPLA621 IPLA1687）（IPLA947）（Cuesta et al.,1996）MRS 肉汤（Biokar, Beauvais, France） M1