基因表达系列分析SAGE技术PPT概要.pptVIP

基因表达系列分析(serial analysis of gene expression，SAGE) 生命科学学院 细胞生物学专业 常用的研究基因差异表达的实验方法 传统研究基因表达差异方法的不足 常规 SAGE方法的操作步骤及原理 1、生物体特定阶段组织或细胞中全部mRNA的制备。 2、cDNA的双链的合成 以biotinylated oligo(dT）为引物将mRNA反转录合成cDNA 。 3、锚定酶酶切 锚定酶具有4bp的识别位点，常用的锚定酶如：NlaⅢ，其酶切位点为CATG 4个碱基序列。酶切后产物通过生物素磁珠（链霉素抗生物素蛋白珠）分离含polyA尾的cDNA片段，将此产物平均分为2份。 4、cDNA片段与接头（Linker）的连接 接头包括4条链：Linker 1A、Linker 1B、Linker 2A、Linker 2B。将Linker 2A以及Linker 2B末端去磷酸化，并与相应的Linker 1A以及Linker 1B进行退火形成接头Linker 1和Linker 2.（接头末端含有锚定酶以及标签酶酶切位点）。 5、标签酶酶切释放标签序列 标签酶是一种Ⅱ类限制酶，它能在距识别位点约20碱基的位置切割DNA双链。 6、连接形成双标签（Ditages） 将含有Linker 1和Linker 2的标签在连接酶的作用下连接形成Linker1、