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FRET 原理(Principle) 荧光标记利用FRET技术检测不发光分子间相互作用的策略 * * 陈 同 生 华南师范大学信息光电子科技学院 荧光共振能量转移Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) 分子能级与荧光 S0 S1 T1 hn0 hn1 hn2 2. 荧光（Fluorescence)：当处于基态的分子吸收光能后进入激发态，并且立即返回基态并以光的形式释放能量，这种光称为荧光。 4. 激发(Excitation, Ex)和发射(Emission, Em)光谱（Spectra): 1. 能级（ Energy Level）：原子的可能状态是不连续的，因此各状态对应能量也是不连续的。包含电子能级、振动能级和转动。 3. 磷光（Phosphorescence）:分子从激发三线态返回基态以光的形式释放能量。 CFP Ex. 440nm Ex. 470nm Em. 470nm YFP Em. 535nm 荧光共振能量转移(FRET)现象 3. FRET现象的特征: 选择性激发供体,却能检测到受体发射的荧光 1. 供体(Donor, D) Donor 2. 受体(Acceptor, A) Acceptor FRET的条件 发生FRET需要三个条件： 1、供体分子的发射光谱和受体分子的吸收光谱必须有显著的重迭，一般大于 30％； 2、供体分子和受体分子间的距离必须在 1 – 10 nm 之间. D和A间的FRET 效率： 3、供体分子的发射态偶极矩与受体分子的吸收态偶极矩、以及它们的向量必须满足一定的条件 R0: E=50%时供体和受体分子间的距离.对于特定的供体受体对是常数; R: 供体和受体分子间的距离. E: FRET效率. 对于R特别灵敏. 举例: 假设 R0=5nm, 1） R=10nm, E=1.5% 2） R=5nm, E=50% 3） R=6nm, E=25% 450 500 550 600 l (nm) D Em A Ex 1)蛋白分子的共定位; 2)蛋白分子聚合体; 3)转录机制; 4)转换途径; 5)分子运动; 6)蛋白折叠等生物学问题. FRET的应用 通过 FRET 技术可以获得有关两个蛋白分子之间相互作用的空间信息。常用于解决如下问题: Laser Laser D A FRET技术应用一:检测两个发光分子间的重合与共定位 FRET技术应用二: 检测分子间的相互作用 Laser Laser FRET技术应用三: 检测分子的折叠与构象变化 FRET技术应用举例：细胞内钙离子浓度的实时测量 Miyawaki A, et al., Nature 1997, 388:882-887 (b) BFP-GFP BFP-YFP CFP-YFP CFP-dsRED  GFP-dsRED 在FRET实验中经常使用的供体-受体荧光分子对 2. 绿色荧光蛋白类(Green Fluorescent Proteins, GFPs) 1.染料类(Dye) FITC-Rhodamine Alexa488-Cy3 Cy3-Cy5