高表达miR-122腺病毒载体构建与功能检测.docVIP

高表达miR-122腺病毒载体构建与功能检测 郝军莉，张金华，吴祥云，何茂兰，王 丹 （成都医学院，成都 610500） 摘 要：旨在利用改造后的腺病毒表达载体pDC312-cmv，构建含有8个miR-122表达框的miR-122高表达重组载体p-8miR-122，通过RT-PCR、ELISA、Sourthern blot验证重组载体高表达miR-122水平以及抗乙肝病毒活性的能力. 通过腺病毒的包装、扩增、纯化和滴度检测，获得高纯度的腺病毒并成功检测到miR-122高表达和抗乙肝病毒活性的能力. 关键词：miR-122；腺病毒；高表达；高纯度；抗乙肝病毒活性 中图分类号：Q74 文献标识码：A 文章编号： Construction and identification of miR-122 expressing recombinant adenovirus HAO Jun-Li，ZHANG Jin-Hua，WU Xiang-Yun，HE Mao-Lan，WANG Dan （Chengdu Medical College, Chengdu 610500, China） Abstract：To construct miR-122 overexpression Adenovirus vector，gene including eight miR-122 precursor fragments was inserted into recombinant construct pDC312-cmv. Abilities of the recombinant vector p-8miR-122 to express miR-122 level and anti-HBV activities were analysed by RT-PCR、ELISA、Sourthern blot. Through adenovirus packaging、amplification、purification and titer detection，the pDC312-cmv and p-8miR-122 adenovirus had a high purity，high miR-122 expression levels and significantly anti-HBV activities. Key words: miR-122；Adenovirus；overexpression；high purity；anti-HBV 1 引 言 MicroRNA（miRNA）是一类长度约为bp的非编码小RNA，通过碱基互补配对与靶基因mRNA的3’’untranslated regions , 3’UTR）结合，调控靶基因的表达[1]iR-122在肝细胞中，，在肝脏发育[2]脂代谢[3]病毒感染及肝癌发生中发挥极其重要的作用[4, 5]Lanford等科学家发现miR-122可以作为靶点治疗丙肝病毒（Hepatitis C Virus，HCV）感染，说明miR-122可作为治疗HCV的一个潜在靶点[6]. 前期研究结果表明miR-122通过抑制靶基因cyclinG1）的表达，促进p53的表达和活性，从而抑制乙肝病毒（Hepatitis B Virus，HBV）转录和复制[7][8].在临床肝癌样本中，肝癌组织中miR-122的表达量较对照组癌旁组织显著下调[9]，同时miR-122的下调引发Hepatocellular Carcinoma, HCC）也得到其它研究的证实，miR-122基因敲除鼠自发形成肝纤维化和，在肝脏中重新表达miR-122降低肿瘤发生[10, 11]. 目前miR-122的表达载体表达量有限且没有合适的运输工具，化学合成胆固醇修饰的miR-122 agomir造价高，在动物实验中应用局限，慢病毒载体可以将携带的目的基因整合到宿主的基因组中，可能造成基因组的表达异常. 鉴于腺病毒具有宿主范围广、高滴度、可以感染处于增殖和非增殖期的细胞等优点，故本研究设计含有8个miR-122表达框的腺病毒载体，并体外包装、纯化和滴度检测，以获得高纯度的miR-122高表达腺病毒载体，为临床上乙肝和肝癌等治疗药物的开发提供理论基础及实验依据. 材料与方法 2.1 材料 腺病毒载体DC312、辅助质粒PBHΔE1,E3购自本元正阳基因技术有限公司[12]为本实验室保存 2.2.1 细胞转染 将生长状态良好的肝癌细胞系HepG2消化铺入6孔板中，12-18 h细胞汇合度达到80%-90%，利用lipo2000转染，6 h后每孔用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗3次，换成含有10%小牛血清的DMEM完全培养基2 mL，将培养板放入含5% C