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GFP转基因拟南芥的培养及荧光观察 实验原理： 1.GFP报告基因 全称为绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein， GFP），简称GFP，20世纪60年代在水母中发现的发光蛋白。由238氨基酸组成的单链多肽，在蓝光或紫外光激发下发出绿色荧光，用于蛋白质在活细胞中的准确定位及动态变化观察（分泌蛋白的分选、亚细胞定位） 2.目的基因 MAP65-1，是一种微管结合蛋白，可以根据拟南芥叶片表皮细胞、保卫细胞，下胚轴和根部细胞中微管骨架的分布情况来推断目的基因是否存在。 3.表达载体： 植物表达载体的构建→导入农杆菌自我复制→浸染花粉转入拟南芥； 卡那霉素抗性培养基筛选， 卡那霉素: 抗生素 影响植物细胞叶绿体和线粒体的蛋白合成,引起植株黄化死亡. 卡那霉素能对转基因植物进行筛选实质上是通过卡那霉素抗性基因起作用的。转基因植物由于含有卡那霉素抗性基因而抑制了卡那霉素的作用，所以通过卡那霉素,转化体就很容易从非转化体中筛选出来。 GFP转基因植株 野生型植株 GFP转基因植株 转基因植株 1/2MS培养基 1/2MS卡那抗性培养基 实验材料： GFP转基因拟南芥种子及野生型种子；1/2MS培养基 ；1/2MS卡那抗性培养基； 75％乙醇；10％NaClO；无菌水。 实验步骤： 1.种子春化（ 加蒸馏水放入4℃冰箱中过夜）； 2.75％乙醇消毒1min（混匀，尽量将液体吸净，动作要快）； 3.10％NaClO消毒10min （混匀，尽量将液体吸净，动作要快）； 4. 无菌水洗三遍，用牙签将种子点在培养基表面（每皿4-5颗种子 尽量均匀）； 5.封膜，做好标记，平放于培养架上培养。 实验结果： 荧光显微镜下观察记录实验现象，填表并解释原因 ? 野生型 GFP-tubulin转基因 解释实验现象 根部 (或茎-下胚轴) ?黄化苗 正常 ?下胚轴：卡那抗性培养基上转基因拟南芥下胚轴的叶绿体从数量和大小上都好于黄化苗，下胚轴的微管都呈现绿色。 根：二者均无叶绿体，但转基因拟南芥根部微管呈现绿色。 叶片 ?正常 黄化苗 ? 在叶肉细胞和保卫细胞中，转基因拟南芥观察到绿色荧光标记，但在野生型中未观测到该现象。 结果分析：野生型在卡那抗性培养基与转基因相比出现黄化，短小，叶绿体小，少等长势不优良的现象，是因为野生型不存在卡那抗性基因，而转基因植株存在卡那抗性基因，所以可以将转基因植株在卡那抗性培养基中筛选出来；在转基因拟南芥中，荧光标记在不同位置亮度效果不同，我们认为可能是与不同位置微管分布情况和微管结合蛋白对不同位置的结合效果不同有关。 注意事项： 严格无菌操作. 消毒过程动作要快. 枪头不要重复使用，物品不要拿出超净台. 点种时每个位置尽量只点一颗子. 操作时尽量避免说话和人员走动. 注意小组内的配合和小组间的协调. 思考题： 1 .本实验用的了两种培养基，有何不同？主要作用是什么？ 实验中分别用到了1/2MS培养基和1/2MS卡那抗性培养基。MS培养基是一种常用的植物组织培养基；在1/2MS培养基中无机盐为MS培养基的一半。但在1/2MS卡那抗性培养基中添加了一种抗生素—卡那霉素。卡那霉素能对转基因植物进行筛选实质上是通过卡那霉素抗性基因起作用的。转基因植物由于含有卡那霉素抗性基因而抑制了卡那霉素的作用，所以通过卡那霉素,转化体就很容易从非转化体中筛选出来。 2.什么是GFP? 在生物学研究中有何用途？ GFP是绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein， GFP），简称GFP，20世纪60年代在水母中发现的发光蛋白。由238氨基酸组成的单链多肽，在蓝光或紫外光激发下发出绿色荧光，可以起到标记目的基因的作用。 3.GFP主要使用什么颜色的激发光？你观察到得荧光是什么颜色？ GFP在蓝光或紫外光激发下发出绿色荧光