电镜技术及超薄切片技术(生)试编.pptVIP

电镜酶细胞化学技术 电镜酶细胞化学技术是在光镜细胞化学的基础上发展起来的新的一门技术。酶存在的特定位置称为酶的定位。主要通过酶的活性作用结果间接地证明酶的存在。目前能在电镜下定位的酶有三大类即水解酶、氧化酶和转移酶，有100多种。 注意：在整个处理过程中必须保存酶的活性不受破坏。 以下以氧化还原酶（可分为氧化酶和脱氢酶两种）为例进行说明。 在氧化酶细胞化学反应中含有两个既分开又紧密联系的底物，一个是生理底物如氧或过氧化氢；另一个是捕捉底物，通常是四盐酸3，3‘二氨基联苯胺（DAB）。DAB很容易氧化，经过一系列化学变化生成强嗜锇性的聚合物，再经锇酸固定就形成锇黑。 脱氢酶常用的捕捉剂为铁氰化物，它在酶的作用下被还原为亚铁氰化物，在铜离子的存在下进一步形成高度不溶性的亚铁氰化铜沉淀。 酶细胞化学的常规操作流程 1、固定：常规固定液选取2.5%戊二醛和4%多聚甲醛混合液作为固定 液，常用的缓冲液有二甲砷酸钠缓冲液及Tris缓冲液等。 2、切片：一般采用组织切片机进行切片，厚度在40～60μm，也可以 用冰冻切片机切片。 3、漂洗：用配置孵育液的缓冲液进行漂洗3次，每次10分钟。 4、孵育：孵育时必须在使用前配置新鲜孵育液。将切片放入孵育液内， 在震荡式恒温水浴箱中孵育，孵育温度一般为37℃。 5、漂洗：用配置孵育液的缓冲液进行漂洗3次，每次10分钟，然后用 0.1M二甲砷酸钠缓冲液漂洗3次，每次10分钟，所用缓冲液 要保持在4℃左右。 6、后固定：用0.1M二甲砷酸钠缓冲液配置的1%锇酸固定1小时。 脱水、浸透、包埋、切片同常规超薄切片制作。 7、电镜观察：超薄切片经烘干后直接进行电镜观察。如果反差不好， 可以进行铅—铀双重染色，但必须有不染色的切片对照。 免疫电镜胶体金标记技术 免疫电镜胶体金标记技术也称金标法（或免疫金染色）。金标法是利用胶体金（Colloidal gold）在碱性环境中带负电荷的性质，使其与抗体相吸引，从而将抗体标记。电镜下金颗粒密度很高，清晰可辨。 胶体金是金的水溶胶，主要用还原法制备。较多用的还原剂有枸橼酸钠、白磷、鞣酸、乙醇、抗坏血酸、过氧化氢等。 枸橼酸三钠还原法 1）取0.01%氯化金（HAuCl4或AuCl3HCl溶液）100ml，放入洁净锥形瓶内煮沸。 2）取1%枸橼酸三钠水溶液4ml，加入煮沸的氯化金中。 3）混合、搅拌、煮沸，约5分钟，溶液颜色由蓝→紫→橙红，冷却后即可。 此时胶体金颗粒直径约为15nm。如将枸橼酸三钠的量分别减少至1.5ml、1.0ml、0.75ml,则胶体金颗粒直径将分别增至30、50或60nm. 胶体金标记物（金探针）的制备 1、胶体金标记蛋白质及其纯化 1）取100ml胶体金PH为7.2。 2）称取相应最适量蛋白质，于去离子水中溶解（100ul）。 3）在磁力搅拌器中将上述两液混合、静置。 4）10分钟后再加入胶体金稳定剂，如3%聚乙二醇（PEG）或5% 小牛血清白蛋白（BSA）。 5）用超速离心法去除未标记蛋白质。离心速度和时间取决于金颗 粒大小及蛋白质的种类。胶体金标记羊抗兔IgG，以牛血清白蛋 白稳定者，先用低速离心20分钟（金颗粒20nm者用250转/分，5 nm者用4000转/分，视金颗粒实际大小情况而定离心速度）。留 取上清液，再以高速离心，4℃下离心1小时（金颗粒20nm者用 14000转/分，5 nm者用60000转/分，视金颗粒实际大小情况而定 离心速度）。弃上清液，留取沉淀物备用。 6）将沉淀物用0.02M PBS(pH8.2,内含1%BSA或PEG)悬浮、清 净，高速离心，重复三次，最后将胶体金标记物溶于原液体积 1/10的TBS中，即可应用。 透射电镜样品制备(包埋块制作）操作流程： 取材——漂洗（生理盐水）——前固定（2.5%戊二醛，4oC冰箱2小时以上）——漂洗（0.1M 磷酸缓冲液，3次，45分钟）——后固定(1%锇酸1小时左右）——漂洗（0.1M 磷酸缓冲液，3次，45分钟）——块染（1%醋酸铀2小时）——梯度脱水（50%、70%、80%、90%、100%丙酮各15分钟， 100% 2次，各10分钟）——浸透（丙酮：包埋液=1：1，37 oC烘箱2小时；丙酮：包埋液=1：4， 37oC烘箱过夜；纯包埋液