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土壤微生物的分离鉴定 实验报告 09级生科一班（周一下午组） 安明玉 同组者：陈汶灿、程彬、陈肖然、高琳璐、秦瑶 一、实验摘要 利用分离纯化微生物的基本操作技术对土壤中的微生物进行分离与纯化，根据菌落形态观察、染色鉴定以及一系列的生理生化试验的结果通过查阅《伯杰氏系统细菌学手册》对照种属特征最终判断所分离纯化的细菌所属的属。 二、实验目的 1.学会设计实验方案，分离目的菌，并通过后续实验做出初步鉴定。掌握倒平板和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术。 2.巩固练习显微镜使用方法。 3.明确培养基的配制原理，复习配制培养基及消毒灭菌的一般原理和操作步骤。 4.复习掌握细菌稀释分离和划线分离技术，平板倾注法和斜面接种技术，了解培养细菌的培养条件和培养时间，复习平板菌落计数法。 5.复习掌握细菌的简单染色、鞭毛染色、革兰氏染色的基本原理和操作方法。 6.学习并掌握过氧化氢酶测定、细胞色素氧化酶测定和糖发酵与氧化试验的实验原理及其操作方法。 三、实验原理 1.对土壤中微生物的分离筛选及鉴定 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程成为微生物的分离与纯化，常用的方法有简易的细胞挑取法和平板分离法。 本实验采用平板分离法，该方法操作简单，普遍用于微生物的分离与纯化，其原理包括以下两个方面： (1)在适合于待分离微生物的生长条件（如营养、酸碱度、温度与氧等）下培养微生物，或加入某种抑制剂形成只利于待分离微生物的生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物； (2)微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得纯培养，获得单菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等方法完成。 但是从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落的特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定。有的微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。 土壤是微生物生活的大本营，它所含有的微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离纯化得到许多有价值的微生物菌株。 2. 显微镜的使用及细胞的简单染色和革兰氏染色 现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常称为复试显微镜。 在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，对微生物学研究最为重要，直接影响显微镜的分辨率。 与其他物镜相比，油镜的使用方法比较特殊，需要在载玻片和镜头之间滴加香柏油。这样做有两个原因。一是能够增加照明亮度，如果光线只是经过空气进入物镜，会因为工作焦距很短，有些光线发生折射或全反射，进入物镜的光线少而使视野亮度不够；而滴加香柏油后，因为香柏油与玻璃的折射率相仿（玻璃，n=1.5，香柏油，n=1.52），可以保证视野亮度。二是增加显微镜的分辨率。 利用单一染料对菌体进行染色称为简单染色。通常用碱性染料进行简单染色，原因在于微生物细胞在碱性、中性、弱酸性溶液中通常带负电荷，而染料电离后染色部分带正电荷，很容易与细胞结合壁着色；当细胞处于酸性条件下（如细胞分解糖类产物）所带正电荷增加时，可采用酸性染料染色。 革兰氏染色，革兰氏染色法是复（特殊）染色法中一种最重要的鉴别性染色法之一。该染色法是先将细菌用结晶紫染色，再加媒染剂碘液媒染以增加染料和细菌细胞的亲和力，使它和结晶紫在菌体细胞壁部位形成分子量较大的紫碘复合物，而后用脱色剂酒精或丙酮脱色，最后再用复染剂番红复杂。如果细菌经脱色剂酒精或丙酮处理后不被脱色而保存初染颜色即紫色，即为“革兰氏阳性菌”；若初染被脱色而染上复染剂番红颜色即淡红色，则为“革兰氏阴性菌”。 革兰氏阳性菌的肽聚糖层厚而致密，经过媒染和染色后颜色不易被洗掉，而呈现紫色；而阴性菌肽聚糖层仅1-2层，层薄而疏，与染色剂结合不紧密，颜色容易被洗掉而被番红复复染成红色。 革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，但在具体操作方法上有多种做法。 3.菌株鉴定的生理生化实验 （1）糖发酵与氧化试验 在细菌的分类鉴定中，糖类发酵与氧化测定是一项重要依据。特别是对细菌的鉴定尤为重要。常用的发酵与氧化的糖类包括单糖，双糖，多糖三类：如葡萄糖，蔗糖，淀粉等。 醇类包括五元醇，六元醇;如到金盏花醇，甘露醇等；糖苷类主要包括有水杨苷等。 绝大多数细菌都能利用糖类作为能源和碳源，但由于不同的菌类存在酶类差异，已而对糖类发酵与氧化的能力就有所不同。有的能利用这种而不能利用那种，有的正好相反；有的在糖类发酵与氧化代谢中能分解糖类，产酸产气，有的则只能产酸不能产气。酸产生与否，以及时发酵类型产酸还是氧化类型产酸，可以由预先加在培养基中