地黃根区土壤水提取物对地黄保护酶活性和膜质过氧化的影响.docVIP

地黄根区土壤水提取物对地黄保护酶活性和膜质过氧化的影响 2 试验材料和方法 TC 2 试验材料和方法 \f C \l 1 2.1试验材料 TC 2.1材料 \f C \l 2 供试地黄品种为河南焦作市广泛种植的温85-5。以其无性块根（称“种栽”）作为再繁材料，生产上称做“倒栽留种”。 2.2试验方法 TC 2.1.2 生物试剂 \f C \l 3 本研究于2007年3月中旬在福建农林大学可控温室中施行砂培盆栽试验，采用外源添加地黄根区土壤水浸提液（简称“DHW”）的方法进行模拟连作。根据试验前期筛选的生物测试浓度，选择-1g/mL、0.2 g/mL、1 g/mL、2 g/mL 四个水浸提液浓度，进行平行处理，根据种栽数量设置n≥3次重复，每盆砂量为2000mL，砂厚度为7cm，每盆移栽经过草木灰消毒处理并已长出幼芽的3cm长且粗细均匀的地黄根段，定植5株。按Hoagland营养液配方进行全营养培养，定期添加，直至地黄叶片开始充分展开（两周后），此时，配合营养液的添加量，按上述浓度梯度一次性添加地黄根区土水浸提浓缩液，分别于处理两周后进行光合作用指标、生理生化指标的测定以及形态指标观察。 2.3取样方法 本试验于地黄苗期进行，取样方法是将地黄分为地上部叶片和地下部新生成的须根系两部分，分别进行相关指标的测定，并按照实验要求留样备份。 TC 2.2 试验方法 \f C \l 2 2.4 实验项目 按照实验安排分别依次进行丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量的测定以及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化物酶(peroxidase，POD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、吲哚乙酸氧化酶（IAAO）等抗性相关酶活性的测定。 TC 2.3 各项指标的测定 \f C \l 2 2.4.2相关酶活性及MDA含量测定 TC 2.3.3 细胞保护酶活性、MDA和蛋白质含量测定 \f C \l 3 分别取标记地黄叶片1.0g或和新生根系1.0g，采用1600型紫外-可见分光光度计进行下列项目的测定。 （1）根系活力（根系脱氢酶活性）的测定 采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法测定地黄根系活力，测定485nm处OD值，以TTC还原量表示根系活力（g/g·hFW）。 （2）POD活性的测定 参照张志良等的方法测定[64]。470nm处比色。以每分钟内OD470变化值表示酶活性大小（△OD/g·minFW）。 （3）SOD活性的测定 参照朱广廉等的方法[62]。测定560nm处OD值,以每分钟抑制NBT光氧化还原50%的酶用量为一个酶活性单位（U/gFW）。 （4）CAT活性的测定 用过氧化氢还原法测定[63]，测定液于240nm处比色，以每分钟内OD240变化值表示酶活性大小（U/g·minFW）。 （5）MDA含量的测定 参照朱广廉等的方法[62]。测定OD532、OD600和OD450值，按公式C（umol/L）= 6.45（OD532- OD600）-0.56OD450计算MDA含量（nmol/gFW）。 （6）IAAO活性的测定 采用2，4-二氯苯酚比色法分别测定地黄叶片和新生根系中吲哚乙酸氧化酶的活性[241]。实验中采用吲哚乙酸试剂B作为显色剂，在530nm波长下比色，查标准曲线，计算被酶分解破坏的吲哚乙酸量，以每mL酶液在1h内分解破坏吲哚乙酸量（ug）表示酶活力的大小[ug（IAA）/g·h]。 （7）PAL活性的测定 参照多诸多方法并改进[]，取材料0.5g，加入5mL预冷0.2mol/LH3BO4（内含54 mmol/L巯基乙醇，pH8.8），在冰浴中研磨成匀浆，4℃下12000g离心30min，上清液即为粗酶液；取此上清液0.5mL，0.2mol/LH3BO40.5mL，50mmol/L的L-苯丙氨酸（用0.2molH3BO4缓冲液配制）0.5mL，以0.5mL 0.2mol/LH3BO4代替L-苯丙氨酸设置空白对照，37℃暗反应1~2h后，测定OD290，以每小时OD290值每0.01的变化所需酶量为一个PAL酶活性单位（U/g 3 结果与分析 3.3 地黄根区土壤水提取物（DHW）对地黄保护酶活性和膜质过氧化的影响 3.3.1 DHW对POD活性的影响 POD(过氧化物酶)的作用一方面可以催化过氧化氢及某些酚类物质的分解，使活性氧的产生和消除处于平衡状态，从而保护细胞免受伤害;另一方面它参与叶绿素的降解。活性氧的产生能引起膜脂过氧化，使质膜透性增强，POD酶活性强说明膜脂过氧化、膜透性增加，植物生长受到胁迫，从而抑制生长。由图3可以看出，DHW处理后地黄幼苗根系POD先升高（183.4%），后又降低（155.1%和136.7%