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目的基因片段的PCR扩增与克隆 1. PCR技术 Polymerase Chain Reaction 聚合酶链反应 它是一种模拟天然DNA复制过程，在有DNA模板、DNA聚合酶（Taq酶）、RNA引物和四种dNTP的情况下，通过高温变性（90℃－95℃，1－2min）,低温退火（25℃－37℃，1－2min）,中温延伸（60℃－75℃，90 sec-5min）,这样反复循环的过程中，在体外扩增特异性DNA片段的分子生物学技术。 1）、PCR反应成分： Taq DNA聚合酶 引物浓度：一般0.1-0.5μmol/L dNTP:一般为50－200μmol/L Mg2+ 模板：PCR对模板的要求不高，单、双链DNA均可，但样品中不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂以及能与 DNA结合的蛋白质。 添加剂：DMSO（二甲基亚枫），提高扩增效率及特异性 （1） 理论上PCR合成产物的数量经过每轮循环都将增加一倍，应按2n的指数方式递增，PCR反应30轮循环后，PCR扩增应达到230个拷贝，约109个拷贝。但由于DNA聚合酶的质量、待扩增片段的序列及反应系统的条件等各种因素的影响，实际扩增效率比预期的要低，一般可达106－107个拷贝。 “平台效应”：PCR反应中，当引物－模板与DNA聚合酶达到一定比值时，DNA聚合酶催化反应趋于饱和，即PCR反应不再增加。平台效应在PCR反应中是不可避免的，但一般在平台效应出现前，PCR产物的数量足以满足实验的需要。 （2）PCR反应条件的优化 PCR方法操作简便，但影响因素颇多，因此需要根据不同的DNA模板，摸索最适条件。主要从： 反应的特异性、敏感性、真实性、扩增效率等四个方面衡量PCR反应的结果。 ①循环参数 变性 退火 延伸 ②PCR反应成分 （3）PCR反应引物的设计 引物的设计在整个PCR扩增中占有十分重要的地位。 特异性，扩增性 ①引物的序列应位于基因组DNA的高度保守区，且与非扩增区无同源序列。这样可以减少引物与基因组的非特异性结合，提高反应的特异性 ②引物长度：15－40bp为宜。引物过短或过长均可使反应的特异性下降。 ③引物的碱基尽可能随机发布，避免出现数个嘌呤或嘧啶的连续排列，G+C碱基的含量在40％－75％之间。 ④引物内部应避免形成二级结构，特别是引物的末端应避免有回文结构。 ⑤二个引物不应有互补序列，特别是3’端应避免互补，以免形成“引物二聚体”，浪费引物。 ⑥引物5’末端碱基无严格限制，在与模板DNA结合的引物长度足够的条件下，其5’端碱基可不与模板DNA互补而呈游离状态，因此可在引物5’端加上限制性内切酶位点、启动子序列或其它序列等以便于PCR产物的分析克隆等，引物的5’端最多可加10个碱基而对PCR反应无影响。 PCR反应系统总体积10 μL，模板DNA的量为植物总DNA 10 ng。 PCR反应体系(10 μL) 体系各成分 用 量(μL) sterile water 4.0 10×Taq buffer 1.0 引物1(20p mol L-1) 0.2 引物2(20pmol/μL) 0.2 MgCl2(25m mol L-1) 1.0 4dNTP(2.5m mol L-1) 1.0 Template DNA 2.5 Taq酶(3U) 0.1 各对引物的复性温度不一样，用x代替。延伸时间用y代替，其中片断长度如果大于1kb，y为1.5 min；大于2kb，y为2.0 min；片断长度如果小于1kb，y为1 min。扩增按如下程序进行： step1 94℃ 5 min 预变性 step2 94℃ 1 min 变性 step3 X℃ 1 min 复性 step4 72℃ y min 延伸 step5 GO TO step2 30循环 step6 72℃ 10 min 延伸 step7 4℃ 10 min 保温 step8 End 扩增产物于0.8%的琼脂糖凝胶80伏电泳2 h，溴乙锭染色，凝胶成像仪观察分析扩增结果。若扩增谱带明显，并具有特异性，则挖带进行进一步扩增；若扩增谱带不明显，或特异性较差，则改变PCR条件，直到扩增出特异谱带。 凝胶加样缓冲液：0.25％溴酚兰；0.25％二甲苯青FF；40％（w/v）蔗糖水溶液；1×TAE 在琼脂