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烟草的组织培养技术 目的与要求 验证“植物细胞全能性”理论 。 学习用生长调节剂对植物器官发生的诱导方法。 实验原理 植物组织培养是指在无菌条件下，分离、并在培养基中培养离体植物组织（器官或细胞）的技术。植物组织培养的理论依据是植物细胞的全能性，即植物体的每个活细胞都有相同的遗传组成，在适当条件下具有繁殖出完整植株的能力。植物组织当中原本已经分化的细胞，组织、器官一旦脱离原有的机体环境，成为离体状态，在适宜的营养和外界条件下，就会表现出细胞的全能性，从已经分化的细胞通过脱分化，成为重新具有分裂能力的胚性细胞，并能再分化重新生长发育成完整的植株。 愈伤组织：是指一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化不断分裂、增生子细胞，这些细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明，逐渐形成了无序结构的细胞团。 脱分化：已经分化的细胞，发生生理、生化的改变，退回到胚性细胞的过程。 再分化：经过脱分化的细胞或组织再次获得分化成不同功能的细胞、组织、器官或完整植物体。 材料和用具 材料：无菌烟草叶盘（已经诱导成芽），拟南芥。 用具：超净工作台、高压灭菌锅、培养箱、电子天平、移液器、手术解剖刀、大、小镊子、30ml烧杯、500ml烧杯、药勺、玻璃棒、培养瓶、平皿、试纸（PH5.4-7），报纸等。 试剂：MS培养基、0.5mol/LNaOH、1mol/L HCl。 操作步骤 （一）诱导培养基配制（见表1） 加MS储液（储液配置见附表） 大量元素和微量元素的母液都是高浓度的，为防止混合后发生沉淀，建议加完大量元素后先加水（约总体积3/4），再加各微量元素和有机成分。铁盐也是微量元素，因为易发生沉淀，所以与其它微量元素分开配。储液中的铁盐存于棕色瓶中。配好的储液应当4℃保存。表1是4瓶培养基（1 表1 诱导培养基配制表 成分 实际称取量 蒸馏水 120 ml MS母液 15 mL 蔗糖 4.5 g 用蒸馏水粗略定容至 100ml pH值 5.8 琼脂 1.2 g 加蔗糖（3%）（m/v）。蔗糖是碳源，同时起到维持渗透压的作用。 调pH=5.8。pH过低，高温处里时间过长，都可能会使培养基不凝。 加琼脂（0.7-0.8%）（m/v）琼脂粉是固化剂、支持物。 （二）灭菌 培养基、解剖刀、镊子、平皿需在高压灭菌锅120℃，灭菌15min 接种前打开无菌间和超净台紫外灯照射30min。 用肥皂洗手和手腕。进入无菌间，先用70%酒精或新洁尔灭喷手。关掉无菌间棚顶紫外灯，打开超净台风机，关掉超净工作台上的紫外灯。 接种 坐在超净工作台前，用70%酒精棉球擦拭双手、培养瓶和超净台面。 待手上的酒精干了，点燃酒精灯。 将培养瓶的盖子旋松，但不要打开，放到无菌风道侧面备用。将镊子、解剖刀在酒精灯外焰上灼烧，待其冷却后，放到培养皿上备用。 用镊子和解剖刀取出一块叶盘，放到平皿上，切取烟草叶芽1-2块，插入培养基。 用酒精灯火焰上灼烧瓶口，瓶盖数秒（阻断微生物进入），拧上瓶盖，不必太紧。 注意：无菌操作时不要讲话，以免污染。用酒精对双手消毒时，务必待酒精彻底挥发后再靠近酒精灯火焰，以免火焰伤手。进出无菌间关好缓冲间的推拉门。 培养4周，25℃，光照16小时，暗8小时，湿度70%-80% 五 实验结果 第二周生长情况 拟南芥1：1号拟南芥种子开始膨胀，略微膨大，但是并未发芽，无明显变化。 拟南芥2：2号拟南芥中有一至二个种子开始发芽，芽的形状不规则，并且显得略微发黄。芽只是茎的部分露出培养基的上方，芽与根都在培养基中，推测原因是种子相对于培养基的位置影响，发芽的一面面朝培养基，故芽孢向培养基中生长。 烟草1：生长状态较好，发育较快，已经占据了整个培养瓶的空间，茎秆粗壮，叶片绿色略带黄色，根系较发达，伸张至整个培养瓶的培养基。 烟草2：生长状态较好，同1号烟草。区别在于根系更发达，有部分根伸张到培养基的表面，暴露在空气中。 2.第三周生长情况 拟南芥1：同第二周时的状态，无明显变化。 拟南芥2：最初生长出的芽死了几个，只有一个芽显浅黄色，其它已发的颜色渐渐变深，显现出与培养基相近的褐色。表明色素对拟南芥种子的发芽有影响，可以渗透到萌发的芽中。 烟草1：生长情况与第二周时相同。有限的培养瓶生长空间与培养基中有限的营养物质，限制了烟草苗的进一步生长。但染料的颜色略微变浅。 烟草2：生长情况与第二周相似，只是叶片的大小有长大。最明显的变化是培养基的颜色，最初的深红色此时已成了浅红，颜色变化较大。 3.第四周生长情况 拟南芥1：依旧无萌芽，只是种子更加膨大。 拟南芥2：芽的大小与前两周相同，无明显变化。推测原因是温度较低，抑制了芽的萌发于继续生长。 烟草1：室内培养两周后，叶片开始显得发黄，茎秆开始变细，为缺乏光照和营养物质的表现，需要移种到外部环境中。 烟草2：叶