生物化学实验四还原糖的测定3,5-二硝基水杨酸比色法.docVIP

实验四 还原糖的测定——3,5-二硝基水杨酸比色法 13生物基地 201300140059 刘洋 2015-03-28 同组者：张奕 实验目的 掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习用3，5-二硝基水杨酸法测定还原糖的方法。 实验原理 单糖和某些寡糖含有游离的醛基和酮基，有还原性，属于还原糖；而多糖和蔗糖等属于非还原性糖。利用多糖能被酸水解为单糖的性质可以通过测定水解后的单糖含量对总糖进行测定。 还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈橘红色，在540 nm处一定的浓度范围内还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量和总糖的含量。 实验器材 1．实验材料：西瓜 2．实验仪器： 25 mL定量管×9 滤纸 烧杯 锥形瓶 100 mL容量瓶 移液器 、移液管 水浴锅 电炉 漏斗 可见光分光光度计 实验试剂 标准葡萄糖液1mg/mL ：准确称取干燥恒重的葡萄糖100mg，溶于蒸馏水并定容至100ml，混匀，4℃冰箱中保存备用 3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂：将6.3gDNS和262ml 2mol/L NaOH溶液，加到500ml含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶中备用。 实验步骤 1.样品处理 将西瓜匀浆，过滤，取3ml加水定容至100ml，混匀备用。 2.制作葡萄糖标准曲线 取6支25 mL定量管编号，按表1分别加入浓度为1 mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。 表1 葡萄糖标准曲线制作 管 号 1mg/mL葡萄糖标准液（mL） 蒸馏水（mL） DNS（mL） 葡萄糖含量（mg） 光密度值 （OD550nm） 0 0 1.0 3.0 0 ?0 1 0.2 0.8 3.0 0.2 0.120 2 0.4 0.6 3.0 0.4 ?0.271 3 0.6 0.4 3.0 0.6 ?0.419 4 0.8 0.2 3.0 0.8 ?0.548 5 1.0 0 3.0 1.0 ?0.705 将各管摇匀，在沸水浴中准确加热10 min，取出，用冷水迅速冷却至室温，用蒸馏水定容至25 mL，加塞后颠倒混匀。调分光光度计波长至550 nm，用0号管调零点，等后面6~8号管准备好后，测出0～5号管的光密度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg）为横坐标，做出标准曲线。 3. 样品中还原糖的测定 取3支25 mL定量管，编号，按表2所示分别加入待测液和显色剂，将各管摇匀，在沸水浴中准确加热10 min，取出，冷水迅速冷却至室温，用蒸馏水定容至25 mL，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。调波长550 nm，用0号管调零点，测出6～8号管的光密度值。 表2 样品还原糖测定 管 号 还原糖待测液（mL） 蒸馏水（mL） DNS（mL） 光密度值（OD550nm） 查曲线葡萄糖量（mg） 平均值 6 0.5 0.5 3.0 ?0.494 ?弃 0.72 7 0.5 0.5 3.0 ?0.502 ?0.72 8 0.5 0.5 3.0 ?0.502 ?0.72 实验结果 计算出6、7、8号管光密度值的平均值，在标准曲线上分别查出相应的葡萄糖毫克数，按下式计算出样品中还原糖百分含量(以葡萄糖计)。 还原糖浓度= 查曲线所得葡萄糖毫克数× 100 3 =48mg/ml 稀释后样品液毫升数 讨论与结论 1. 标准曲线制作与样品测定应同时进行显色，并使用同一空白调零点和比色。 2. 在使用移液管时仍要注意控制流量，防止加多。 3. 在使用移液器时，如果枪尖内有液体残留，应贴壁使液体缓缓流出，防止误差过大。 光密度值 葡萄糖含量（mg）