豌豆凝集素基因的克隆與转化烟草的研究.docVIP

豌豆凝集素基因的克隆与转化烟草的研究 周小全，张兴国＊ （西南大学园艺园林学院蔬菜实验室 重庆 400716） 摘要：豆科植物凝集素在植物对其相应的根瘤菌识别中起重要作用。设计特异引物扩增出豌豆(Pisum sativum L.)凝集素基因(psl)，并亚克隆到植物表达载体pVCT2020中，经根癌农杆菌EHA105介导,采用叶盘法转化烟草（Nicotiana tobacum L.）。通过PCR分析鉴定Kan阳性植株。鉴定过程中排除了农杆菌DNA干扰造成PCR假阳性的可能，证明psl基因已经整合到烟草基因组中。该转基因烟草可进一步用于与豌豆根瘤菌的相互作用分析。 关键词：豌豆凝集素；DNA克隆；转化；烟草；PCR；鉴定 Cloning of Pea Lectin Gene and Its Transformation into Tobacco Zhou Xiao-Quan ，Zhang Xing-Guo＊ （College of Horticulture and landscape Architecture,Southwest University Chongqing 400716 China） Abstract: The leguminous lectins play an important role in recognition of host plants to their own rhizobia. The pea lectin gene was amplified by PCR, using specially designed primers. It was then subcloned into plant expression vector Pcvt2020. Tobacco was transformed by co-cultivating leaf disc via Agrobacterium mediation. The regenerated Kanamycin-resistant transformants were analyzed by PCR, eliminating interference from the Agrobacterium DNA. These results indicated the pea lectin gene integrated into the tobacco genomic DNA. This transgenic plants could be used in researches on the interaction with Rhizobia. Key words: pea；lectin；DNA cloning； transformation；tobacc；PCR；identification 氮素在农业生产中一直发挥着重要作用，全球每年可供利用的还原态氮中约有60％来自生物固氮，其中豆科植物固氮量占82%[1]。提高生物固氮的量不仅可以降低能源消耗还可以减少环境污染。人们试图通过分子生物学手段打破根瘤菌的宿主专一性障碍，从而扩大共生固氮的范围。Hamblin等1973年首次报道了根瘤菌与凝集素的相互作用，他们提出假说：与菜豆凝集素相结合的根瘤菌到达菜豆的根部，在适当的位点感染植物[2]。Boblool等1974年指出凝集素在宿主植物专一性识别根瘤菌的过程中起着特殊作用，豆科植物凝集素在豆科植物根表面与适当的根瘤菌表面的特异性多糖产生特异性的相互作用[3]。Dazzo等1985年提出：三叶草根瘤菌吸附到三叶草根表面时,以其凝集素作为中介，使三叶草根瘤菌选择性地在三叶草根毛上积累[4]。Díaz 等1989年报道：在豆科植物和根瘤菌共生作用中，宿主植物的凝集素起决定作用[5]；他在1995年用转豌豆凝集素基因（psl）的三叶草接种豌豆根瘤菌，获得结瘤固氮功能[5]。这些研究成果说明，凝集素基因的转化可以扩大根瘤菌的宿主范围。 在非豆科植物转化方面，Edwards GA等1991年将psl转入了马铃薯，但是未进行进一步的结瘤固氮方面的研究。张静娴、荆玉祥等利用CaMV 35S启动子将psl转化到烟草与水稻中，并获得了表达[7、8]。本研究是在克隆了包含启动子和终止序列的psl的基础上，进一步把该基因导入烟草中，从而为深入研究转psl的非豆科植物与根瘤菌相互作用奠定了基础。 1 　材料与方法 1.1 植物材料 豌豆(Pisum sativum L.)种子为重庆地区市售的食用豌豆，烟草(Nicotiana tobacum L.cv.Wisconsin38)为本实验室提供。 1.2 菌株与质粒 　　大肠杆菌(XL1-blue)和农杆菌(EHA105)