酶的特異性(专一性)及影响酶活性的因素.docVIP

酶的特异性（专一性）及影响酶活性的因素 实验目的 掌握检查酶特异性的方法和原理。 了解温度对酶活性的影响。 了解激活剂、抑制剂对酶活力的影响。 实验原理 1. 酶的专一性 酶是生物体中一种具有催化功能的特殊蛋白质（传统酶的概念），也常称为生物催化剂。它与一般催化剂的最主要区别就是具有高度的特异性，即专一性。根据各种酶对底物的选择程度不同，可分为绝对专一性、相对专一性、立体异构专一性，。例如唾液淀粉酶属于相对专一性酶，它只能随机作用于淀粉链内部的a——1，4糖苷键，使其分子迅速断裂成较短的链，称为糊精，糊精分子量递减，淀粉——大分子糊精——中分子糊精——小分子糊精——简单分子糊精——麦芽糖和a——糊精（含a——1，6糖苷键的短链聚糖，平均分子量为8个残基）。 由于淀粉酶催化所形成的产物都是还原糖，故可用灵敏度较高的Benedict试剂检测和观察。 2.温度对酶促反应速度的影响 酶的催化作用受温度的影响很大，与一般化学反应一样，提高温度可以增加酶促反应的速度，通常温度每升高10℃，反应速度加快一倍左右。另一方面酶是一种蛋白质，温度过高可引起蛋白质变性，导致酶的失活。因此，反应速度达到最大值以后，随着温度的升高，反应速度反而逐渐下降，以至完全停止反应。反应速度达到最大值时的温度称为酶作用的最适温度。大多数动物酶的最适温度为37—40℃，植物酶的最适温度为50—60℃。但一种酶的最适温度不是完全固定的，它与作用的时间称短有关，反应时间增长时，最适温度向数值较低的方向移动。最适温度不是酶的特征性物理常数。酶对温度的稳定性与其存在形式有关。大多数酶在干燥的固体状态与比较稳定，能在室温下保存数月至一年，溶液中的酶，易被微生物污染，常难长期保存，在高温的情况与，如100℃即可失活。低温降低或抑制酶的活性，但不能使酶失活。 3. 激活剂和抑制剂对酶活力的影响 酶的活性常受某些物质的影响，有些物质能增加酶的活性，称为酶的激活剂；另一些物质则会降低酶的活性，称为酶的抑制剂。例如氯离子为唾液淀粉酶的激活剂，铜离子则为该酶的抑制剂。通常情况下，很少量的激活剂或抑制剂就会影响酶的活性，而且常具有特异性，但是激活剂和抑制剂不是绝对的，有些物质对不同的酶所起的作用不同，如镁是脱羧酶烯醇化酶的激活剂，但是肌球蛋白ATP酶的抑制剂，同一种酶也可因激活剂的浓度不同而作用不同，如CL-在低浓度时是激活剂 ，达三分之一饱和度时则变为抑制剂。 器材和试剂 1.配制的溶于0.3％氯化钠的0.5％淀粉溶液： 2. 新配制的溶于0.3％氯化钠的0.1％淀粉溶液： 3.新配制的溶于0.3％氯化钠的0.2％淀粉溶液： 4.新配制的溶于0.3％氯化钠的1%淀粉溶液： 5.稀释的新鲜唾液。漱口后将唾液吐入量筒内收集约10ml加水至200ml，取0.2%的淀粉2ml，唾液2ml混匀，每间隔1分钟取1-2滴于白磁反应板内，加KI-I检测，控制酶的浓度使反应刚好在4-5分钟内完成。 6. 碘化钾－碘溶液:将碘化钾20克及碘10克溶于100毫升水中。使用前稀释10倍。 7.本尼迪克特（Benedict）试剂: 取86.5克柠檬酸钠（Na3C6O7·2H2O）和50克无水碳酸钠溶于450毫升蒸馏水中；再取硫酸铜（CuSO4·5H2O）8.7克溶于50毫升蒸馏水中；然后将硫酸铜溶液慢慢到入前液，边加边摇动；最后加蒸馏水稀释至500毫升（本试剂可长期保存）。 8. 1％氯化钠溶液：10、铜溶液：11、%硫酸钠溶液 12恒温水浴锅、沸水浴、移液管、电子天平 操作步骤 淀粉→分子糊精-→中分子糊精→小分子糊精→麦芽糖和α-糊精 KI-I 蓝 蓝紫 褐 红 不呈色 不呈色 一、酶的专一性 取5支试管，编号并按下表操作： 管 号 1 2 3 4 1%淀粉溶液 4滴 — 4滴 — 2%蔗糖溶液 — 4滴 — 4滴 稀释唾液 1毫升 — 1毫升 — 蒸馏水 — 1毫升 — 1毫升 37℃恒温水浴15min Benedict试剂 1毫升 1毫升 1毫升 1毫升 沸水浴5min 现 象 二.温度对酶活力的影响 （一）淀粉和可溶性淀粉遇碘呈蓝色。糊精按其分子的大小，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色或红色。最简单的糊精遇碘不呈颜色，麦芽糖遇碘也不呈色。在不同温度下，淀粉被唾液淀粉酶水解的程度可由水解混合物遇碘呈现的颜色来判断。 （二）取三支试管，编号后按下表加入试剂： 管 号 1 2 3 淀粉溶液(ml) 1.5 1.5 1.5 稀释唾液(ml) 1 1 - 煮沸过的稀释唾液(ml) - - 1 (三)摇匀后，将1、3号两支试管放入37℃恒温水浴锅中，2号试管放入冰水中。10分钟后取出（将2号管内液体分为两半），