第八章_园艺植物基因的分离与克隆.ppt

一、基因芯片的原理 （一）基因芯片的原理 将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，然后使其与待测的标记样品基因按碱基配对原理进行杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较和检测，从而迅速得出所要的信息。 （二）cDNA微阵列芯片 将克隆到的成千上万个基因的特异探针或所构建的cDNA文库内的cDNA片段固定在一块DNA芯片上。 对来源于不同的个体、组织、发育阶段、或诱导处理条件下差异表达的mRNA反转录为cDNA进行检测，找出差异表达的序列。 以差异序列设计探针即可从文库中筛出相应的克隆，经测序鉴定就可以确定是否为新基因。 二、基本程序 DNA阵列的构建和印制 根据研究目的选用合适的寡核苷酸、cDNA片段或特定的功能基因，构建点阵列。 将所需的核酸片段原位合成于芯片上，或以大致相当的浓度，按一定的排列方式点样在特定的固相支持物(如玻片、硅片、尼龙膜等)上。 靶（待测）样品的准备 包括DNA或mRNA的分离、纯化、扩增及标记。 标记的方法：在扩增的底物中加入荧光标记的寡核苷酸单体，如用Cys3和Cys5标记的dUTP。 分子杂交和检测 将标记好的样品与芯片进行分子杂交，反应结束后将洗去未杂交上的样品，用激光共聚焦显微镜检测。 基因芯片上每一点对芯片表面各个点荧光信号的强弱进行定量