分离放线菌概要.ppt

模块四、从土壤中分离、纯化放线菌 一、目的： 1.掌握从土壤中分离放线菌的技能 二、知识内容和要求： 1.理解微生物分离纯化实验的稀释原理 2.理解选择性培养基的原理。 三、技能内容和要求： 1.能使用梯度稀释、涂布分离对微生物进行分离纯化。 从土壤中分离、纯化放线菌 1操作目的： 1.1验证土壤中存在有大量微生物 1.2掌握从土壤中分离纯化微生物的技能 从土壤中分离、纯化放线菌 2.操作原理 ①通过提供只有利于某种微生物生长繁殖的最适培养基和培养条件 ②在培养基中加入抑制剂，抑制除一种/类微生物外其他微生物的生长繁殖 ③控制培养条件，利于某一种/类微生物而抑制其他微生物的生长繁殖 从土壤中分离、纯化放线菌 2.操作原理 2.1自然界广泛分布有各种微生物，尤其是在土壤中，在有机质丰富、水分充足，距地表10~20cm的土壤中，有细菌、真菌、放线菌、藻类、原生动物和病毒等。可以通过技术手段将某一种微生物单独分离出来。 2.1.1将菌悬液充分稀释后取少许接种于适宜的培养基上，使其分散成单细胞，或者在培养基表面不断地划线，将菌一个个地拉开，培养后会形成一个个的菌落，即形成单菌落。 从土壤中分离、纯化放线菌 3.实验器材、试剂 恒温培养箱、培养皿、1ml/10ml移液管、玻璃刮铲、接种环、酒精灯、三角瓶、试管、玻璃珠、脱脂棉等。 富含腐殖质的土壤 高氏1号琼脂培养基（P65 ）、蒸馏水、1mol/L的NaOH与HCl溶液，10%酚溶液 从土壤中分离、纯化放线菌 4.操作前准备： ①采土：取距地表10~20cm的富含腐殖质的土壤20g左右，置于实验室内自然风干。 ②常法配制高氏1号琼脂培养基，分装于三角瓶内。 ③培养皿、移液管、玻璃刮铲用报纸包好。 ④将玻璃珠和90ml蒸馏水置于三角瓶内塞上棉塞。 ⑤一些空试管和6支各加水9ml的试管塞好棉塞。 ⑥将上述②~ ⑤物品121℃灭菌20min ，备用。 从土壤中分离、纯化放线菌 5.操作方法： 5.1配制高氏1号琼脂培养基。 配方：可溶性淀粉 20g； NaCl 0.5g ； KH2PO4 0.5g； FeSO4 0.01g； MgSO4 0.5g； KNO3 1g 琼脂 20g pH7.2~7.6 配制方法：先取小烧杯加冷水100ml，将淀粉调成糊状；大烧杯或不锈钢小锅加水500ml加热，依次称取、加入其他成分，琼脂剪碎，倒入水中，继续加热煮沸，边加热边搅拌至完全熔化，防止糊底；将淀粉糊倒入沸腾的水中，边加边搅拌，防止糊底。关火后加沸水补足至1000ml，调节pH至7.4~7.8，分装。112℃灭菌20分钟。 从土壤中分离、纯化放线菌 5.操作方法： 5.2倒平板。取2套无菌平皿，在皿底贴上标签，注明土壤稀释液的稀释度（ 10-4、10-5每个稀释度做一个培养皿 ）、组别、姓名、操作日期等。然后在每皿中倒入冷至50℃左右的培养基15~20ml，冷凝成平板。倒平板前在培养基内滴加10 %酚溶液数滴后混匀。酚属于抑制剂，可以使细菌、霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌 。另取几支试管倒斜面。 从土壤中分离、纯化放线菌 5.操作方法： 5.3制备土壤稀释液。称取10g土壤样品，加入到装有90ml无菌水和玻璃珠的三角瓶中，振荡约20 min，使土样与水充分混匀，将细胞分散，即得到10-1浓度的土壤悬液。用一支无菌吸管从中吸取1 ml土壤悬液加入装有9 ml无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即得到10-2浓度的土壤稀释液。依此法连续稀释制作浓度为10-3~10-5梯度的土壤稀释液。 从土壤中分离、纯化放线菌 5.操作方法： 5.4涂布分离。将无菌平板编上10-3~10-5 号码，每一号码设置三个重复，用无菌吸管按无菌操作要求吸取10-5稀释液各0.1 ml放入3个平板中，同法吸取10-4、10-3稀释液各0.l mL放入编好号平板中（用无菌吸管从浓度最小稀释液开始）。再用无菌玻璃涂棒/铲将菌液在平板上涂抹均匀（从浓度小的稀释液开始）。 从土壤中分离、纯化放线菌 5.操作方法： 5.5恒温培养。接种后的平皿倒置于28℃恒温培养箱内4~5d。 5.6挑菌。将培养后生长出的单个菌落分别挑取少量细胞接种到高氏1号培养基斜面上。28℃条件下培养3～5d。 5.7纯化。将斜面菌再经过划线接种转接到平板上， 28℃恒温培养箱内培养24~48h 。 如果发现有杂菌，需要进一步分离、纯化，直到获得纯培养。 从土壤中分离、纯化放线菌 如何区分放线菌和真菌、细菌？ 放线菌菌落小而紧密、干燥、不透明、