银杏果多糖抗氧化活性的初步研究.doc

银杏果多糖抗氧化活性的初步研究 1 材料与仪器 1.1材料 银杏果，收集于沈阳农业大学校园内（10月份采摘）; NBT( 氯化硝基四氮唑蓝)，上海恒星应用化学研究所；核黄素，北京奥博星生物技术责任有限公司；1，1-二苯- 2-苦肼基( 1，1- diphenyl- 2-picrylhydrazyl， DPPH， 纯度 95%) ，A Johnson MattheyCompany; 其他所用试剂均为国产分析纯。 1.2仪器 数字恒温水浴锅，常州国华电器有限公司；低速离心机，北京医用离心机厂; 循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；SL- 202 型电子天平，上海长 桥精密科学仪器有限公司超净工作台，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；日光灯反应箱，自制。 2方法 银杏果多糖的提取 银杏果去核，过 40目筛80%乙醇回流浸提( 水浴温度 60℃)，过滤，滤渣风干样品称重，水提取抽滤，粗多糖提取液浓缩至原体积的1/4，醇析沉淀，冷冻干燥，多糖粗品。 2. 4 银杏果多糖的含量测定 多糖的含量测定：采用苯酚 －硫酸法 葡萄糖标准曲线: 将20 mg 葡萄糖溶解并定容至500 mL 分别量取母液 0. 5 1. 0 2. 0 3. 0 4. 0 5. 0mL， 定容至10 mL， 各量取1 mL 溶液、 1 mL 6%苯酚、5 mL 浓 H2 SO4 摇匀放置10 min， 沸水浴加热15 min，冷却至室温， 在490 nm 波长处测定吸光度值 以含量为横坐标， 吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。 菌丝多糖含量测定: 分别量取不同体积的各种菌丝多糖母液装入具塞试管中， 配制成浓度梯度 然后再从试管中分别量取 1 mL 溶液装入小试管中，并依 次加入1 mL 6%苯酚溶液， 5 mL 浓 H2 SO4， 摇匀放置10 min， 沸水浴加热 15 min，冷却至室温，在 490 nm波长处测定吸光度值， 根据标准曲线计算出不同菌丝中多糖含量。 2. 5 银杏果多糖抗氧化活性的体外测定 将银杏果多糖定容至25 mL，进行如下抗氧化活性的测定。 2. 5. 3 清除 DPPH 活性的测定 采用提取物与稳定自由基 DPPH 反应的分析方法。 在同一具塞试管中加入2 mL DPPH 溶液( 2×10－4mol /L) ， 1 mL 不同浓度样品溶液，摇匀，室温避 光静止30 min， 用无水乙醇作参比在 517 nm 处测定吸光度 A 样品 用1 mL 蒸馏水代替样液，测定空白吸光度A。 空白用2 mL无水乙醇代替 DPPH，测定吸光度值 A 对照 样品对 DPPH 的清除率计算: E /% =［ 1 － ( A样品 － A对照) /A空白］×100 2. 5. 4 还原力的测定 本研究采用铁离子还原法( FRAP) 和铁氰化钾 还原法来测定各样品的还原力 具体方法: 分别取2.5 mL 不同浓度的样品于试管中， 依次加入 2. 5 mL0. 2 moL /L pH 6. 6 的磷酸盐缓冲液和2. 5 mL 1% K3 ［ Fe( CN) 6］ 于50 ℃水浴保温 20 min 后，快速冷却，再加入 2. 5 mL 10% TCA， 以 4 000 r /min 离心 10min， 取上清液2. 5 mL， 依次加入2. 5 mL 重蒸水， 0. 5mL 0. 1%FeCl3， 充分混匀， 静止 10 min， 以蒸馏水为对照在700 nm 处测定吸光度值。 抗卵黄脂质过氧化活性的测定 采用依赖鸡卵黄脂蛋白的脂质过氧化模型，将新鲜卵黄用等体积的0.1mol·L-1 pH 7.4的PBS按1:1配成悬液，再稀释成1:25(卵黄:总体积)，磁力搅拌30min。在试管中加入上述卵黄悬液0.2mL，分别加入样品0.1mL(对照管加入PBS)，再加入25mmoL·L-1的硫酸亚铁0.2mL，最后用0.1 moL·L-1 PBS补至2mL。 3．结果与分析 3. 1 清除 DPPH 活性的测定结果 图 1 银杏果多糖对DPPH自由基的清除率 图 2 银杏果多糖对DPPH自由基的清除率 3. 2抗卵黄脂质过氧化活性的测定 3. 4 还原力的测定结果