2015年基因工程實验手册.docVIP

《本科实验教学》 基因工程实验指导 贵州大学农业生物工程研究院 2015年4月 实验一DNA片断的连接、转化及酶切鉴定 一、实验原理： 实验所用载体为Promega公司T载体pGEM?-T Easy Vector，特点为在载体中存在两个T末端。 使用LA Taq进行扩增得到的大部分PCR产物3’端附有一个“A”碱基。 T4噬菌体DNA连接酶可在体外使外源DNA片段和线状质粒载体之间形成新的3，5磷酸二酯键。PCR胶回收产物游离A末端与载体的T末端可互补配对并在连接酶作用下连接形成重组质粒。 转化指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA分子导入受体细胞体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。大肠杆菌转化常用化学法（CaCl2法），其原理是培养至对数生长期的细菌0℃经过低渗CaCl2溶液，抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时处理，促使细胞，。本实验中本身具有Amp抗性 对培养的含有大量质粒的菌液，离心收集菌体。用含有一定浓度葡萄糖的缓冲液（溶液Ⅰ）悬浮菌体，采用碱性SDS（十二烷基硫酸钠）溶液裂解菌体的细胞壁，使质粒缓慢释放出来，同时整个液体的pH为12-12.5，双链DNA变成单链，当pH调至中性并有高盐浓度存在下，绝大多数变形质粒恢复自然状态溶在液体中，而变形染色体不能复性，断裂呈线性的单链细菌染色体DNA 相互交