AFLP實验操作指南(修改后).docVIP

AFLP实验操作指南 实验操作流程 提取DNA样本 DNA酶切、连接同时进行 反应体系（50ul） 成 分 体 积（ul） 双蒸水 35.8 10*Tango buffer 5 EcoRI(10u/ul) 0.5 MseⅠ(10u/ul) 0.5 Ea （5pmol/ul） 1 Ma （50pmol/ul） 1 10mM ATP 1 T4DNA连接酶（5U/ul） 0.2 模板DNA（100ng/ul） 5 总体积 50 反映程序 37℃反应3~5个小时，最后保存于4℃。 检测 取4－6ul酶切液进行酶切效果检测，跑出的带以弥散状、无明显主带为好。 稀释 按1：10的比例稀释，已稀释的和未稀释的均可长时间储存于-20oC备用。 预扩增 反应体系 成 分 体 积（ul） 双蒸水 4.4 Premix taq 10 EA00(100ng/ul) 0.3 MC00(100ng/ul) 0.3 稀释后已连接DNA模板 5 总体积 20 反映程序 a、94℃ 2min b、94℃ 30s、56℃ 30s、72℃ 1min共24个循环 c、72℃ 5min d、保存于4℃ 检测 取未稀释的预扩增液4－6ul进行琼脂糖电泳检测。 （4） 稀释 取部分预扩增后溶液按1：25的比例稀释。将已稀释的和未稀释的保存于－20℃储存。 4.选择扩增 反应体系 成 分 体 积（ul） 双蒸水 4 Premix taq 10 EA--(100ng/ul) * 0.5 MC--(100ng/ul) * 0.5 稀释后已连接DNA模板 5 总体积 20 *:EA--,MC—后面两个碱基因不同引物对而不同。迅速漩涡混匀10s，或者离心4000r/min，10s。 （2） 反应程序 a、94℃ 4min b、第1～13个循环：94℃ 30s, 65℃ 30s, 72℃ 1min（退火温度每隔一个循环降低0.7℃）； c、第14～36个循环：94℃ 30s, 56℃ 30s, 72℃ 1min； d、72℃ 5min, 4℃保存。 6．变性 （1） 变性剂（Loading buffer）配方 组 分 体 积 98%去离子甲酰胺 49ml EDTA(0.5M PH=8.0) 1ml 二甲苯青FF(Xylene Cyanole FF) 0.125g 溴酚蓝（Bromphenol Blue） 0.125g （2）变性：将7ul 变性剂加入14ulPCR反应产物，95℃变性5min，并迅速置于冰上。 7. 制胶溶液 （1） 一块胶的配方（60ml） 将12ml 5XTBE和25.2g尿素（Urea）混合加水定容至51ml，向其中加入9ml 40％的丙烯酰胺溶液，240ul 10%过硫酸胺（APS）和60ul四甲基乙二胺（TEMED）。 （2） 各组分配方 5X TBE：54g Tris碱( Tris-base）,27.5g硼酸( B-acid）和3.72gEDTA(或0.5M,PH=8.0，EDTA 20ml)混合定容至1L。 40％丙烯酰胺溶液：2g甲叉双丙烯酰胺（N、N-Methylene Bisacrylamide）