04第五章 酶分子修饰.ppt

常用的化学修饰剂 一、氨基修饰剂： 定义：凡能使酶蛋白侧链上的氨基发生改变的化合物。 原理：这类试剂作用于酶蛋白侧链上的氨基或产生脱氨基，或与氨基共价结合将氨基屏蔽起来，使氨基原有的副键改变，从而改变酶蛋白的构象。 主要有：二硝基氟苯、醋酸酐、琥珀酸酐、二硫化碳、亚硝酸、乙亚胺甲酯、O-甲基异脲、顺丁烯二酸酐等。 一、氨基 二、羧基修饰剂： 定义：可与酶蛋白侧链上的羧基反应的小分子化合物。 原理：可使羧基酯化、酰基化或结合生成其他物质，改变酶蛋白的空间构象，从而改变酶的催化特性。 主要有：乙醇-盐酸试剂、水溶性的碳化二亚胺等。 二、羧基 碳二亚胺 三、巯基修饰剂： 原理：半胱氨酸残基侧链中含有巯基。许多酶分子中存在的巯基通过形成二硫键维持蛋白质分子的三维构象，对维持酶的结构稳定性起重要作用。 常用试剂：巯基乙醇、二硫苏糖醇、硫代硫酸盐、硼氢化钠等。 三、巯基 四、胍基修饰剂： 原理：精氨酸含有胍基。二羰基化合物可与胍基缩合生成稳定的杂环。 主要有：环己二酮、乙二醛、苯乙二醛等 四、胍基 五、酚基修饰剂： 原理：酪氨酸残基上含有酚基。经酚基修饰剂修饰后，酶分子由于引入负电荷，增加了对带正电荷底物的结合力，有利于酶催化功能的发挥。修饰酚基的方法有：碘化法、硝化法、琥珀酰化法等。 主要有：四硝基甲烷 五、酚羟基 六、咪唑基 七、吲哚基 八、分子内交联剂： 原理：用含有双功能团的化合物，与酶分子内两个侧链基团反应，在分子内共价交联，可使酶分子空间构象更加稳定，从而也使酶的催化稳定性增加。 主要有：戊二醛、二氨基丁烷、已二胺等。 八、分子内交联修饰 双功能试剂可以在酶分子中相距较近的两个侧链集团之间形成共价交联，从而提高酶的稳定性。 同型双功能试剂 异型双功能试剂 第四节 酶蛋白主链修饰(肽链有限水解修饰) 利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。 酶蛋白主链修饰主要是靠酶切/酶原激活法。 第四节 酶蛋白主链修饰(肽链有限水解修饰) a、胃蛋白酶原（pepsinogen）的激活 b、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活 c、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活 第五节 核苷酸链剪切修饰 在核苷酸链的限定位点进行剪切，是酶的结构发生改变，从而改变酶的特性和功能。 第六节 氨基酸置换修饰 酶蛋白是由各种氨基酸通过肽键联结而成的。在特定位置上和各种氨基酸是酶的化学结构和空间结构的基础。若将肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸，则会引起酶蛋白空间构象的某些改变，从而改变酶的催化特性，这种修饰方法，称为氨基酸置换修饰。 例如： 酪氨酰-tRNA合成酶可催化酪氨酸和其所对应tRNA，若将该酶第51位的苏氨酸由辅氨酸置换，经修饰后的酶对ATP的亲和性提高近100倍，酶活力提高25倍； T4-溶菌酶分子中第3位的异亮氨酸换成半胱氨酸后，该半胱氨酸可与第97位的半胱氨酸形成二硫键，氨基酸置换修饰后的T4-溶菌酶，其活力保持不变，但该酶对热的稳定性却大大提高。 提高酶活力 增强酶的稳定性 改变酶的专一性 第六节 氨基酸置换修饰 置换修饰的作用 Bender等成功地利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性中心的丝氨酸转换为半胱氨酸。 修饰后，该酶失去对蛋白质和多肽的水解能力，却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。 但是化学修饰法难度大，成本高，专一性差，而且要对酶分子逐个进行修饰，操作复杂，难以工业化生产。 第六节 氨基酸置换修饰 置换修饰的方法 化学修饰法 在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术 第六节 氨基酸置换修饰 置换修饰的方法 定点突变技术 第七节 核苷酸置换修饰 将酶分子核苷酸链上的某一个核苷酸换成另一个核苷酸的方法。 第八节 酶分子的物理修饰 通过物理修饰，可以了解不同物理条件下，特别是在极端条件下（高温、高压、高盐、极端pH值等）由于酶分子空间构象的改变而引起酶的特性和功能的变化情况。 特点在于不改变酶的组成单位及其基团，酶分子中的共价键不发生改变，只是在物理因素的作用下，副键发生某些变化和重排。 第九节 酶分子修饰的应用 酶学 医药 工业抗体酶研究开发 核酸类酶人工改造 有机介质酶催化反应 Chapter 5 Modification of Enzyme Molecule 酶分子修饰的产生 酶在生物技术与工程中占有十分重要的地位。酶所具有的反应专一性、催化高效性及反应条件温和等优点，使其广泛应用在工业、农业、医药、环保及能源等领域。 由于酶的本质是蛋白质的特点，在催化反应中受到稳定性、反应条件等制约，早期能大规模应用的酶还不够