基因工程(工具酶).pptVIP

* * 来自小牛胸腺的碱性磷酸酶（CIP） * * 来自大肠杆菌的碱性磷酸酶（BAP） 100℃仅暂时失活，稳定性极强的酶 （3）T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP） T4-PNP的基本特性：在DNA、RNA、dNR、NR的5‘-OH上加磷酸基 5‘ HO 3‘ HO OH 3‘ OH 5‘ T4-PNP Mg2+ pppATP（g-32P-ATP） 5‘ p 3‘ HO OH 3‘ p 5‘ 用于探针的末端同位素标记： 核酸修饰酶 * * T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP） * * 各种Nuclease的比较 * （一）限制性内切酶（Endonucleosase）的发现与分类　　1） 50年代初发现细菌能将外来DNA片段在某些专一位点上切断，从而保证其不为外来噬菌体所感染，而其自身的染色体DNA由于被一种特殊的酶所修饰而得以保护，这种现象叫做限制－修饰，它们由三个基因位点所控制：hsd R, hsd M, 　　　hsd S, 十年后，人们搞清了细菌的限制与修饰分子机理： 　　hsd R---限制性内切酶 　　hsd M---限制性甲基化酶 　　hsd S---控制两个系统的表达 　　1968年Smith等人从流感嗜血杆菌株中分离出两个类内切酶，Hind II和Hind III，为基因工程技术的诞生奠定了基础。 截止到目前为止，已经分离出400余种II类酶，搞清识别位点的有300种，商品化的约有一百种，而实验室常用的有二十种 。 * 2）限制性核酸内切酶可分为三大类： 　　　I类 能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近切割双链，但切割序列没有专一性。　　　II类 识别位点（回文序列）严格专一，并在识别位点内将双链切断 　　　III类 识别位点严格专一（不是回文序列），但切点不专一，往往不在识别位点内部。　　因此在基因工程中具有实用价值的是II类限制性内切酶。 * 二）II类限制性内切酶的命名及特性 　　命名原则：取属名的第一个字母大写，取种名的前两个字母小写，构成基本名称。该种中发现的不同的酶按照顺序编号I, II, III等。如存在变种和品系，取变种或品系的一个字母。若酶存在于质粒上，则需大写字母表示非染色体遗传因子。如，HindIII从Haemophilus Influenzue d株中分离的第三个酶。EcoRI表示基因位于Escherichia coli中的抗药性R质粒上。 * （三）II类限制性内切酶的底物识别顺序及切割位点 　　绝大多数的II类限制性内切酶在底物DNA上的识别顺序长度为4，5，6碱基对，这些碱基对的顺序呈回文结构（Palindromic），而且切点就在其内部，如EcoRI 5-GAATTC-3 。　　DNA被限制性内切酶切开之后，呈现两种断口：　　钝端（平端）如Pvu II, Alu I, EcoR V等　　粘端（粘性末端）如：EcoR I等 * OK, go on * 二、甲基化酶 　　在专一位点上甲基化，与限制性内切酶相对应。　（一）大肠杆菌中的甲基化酶 　　dam甲基化酶: 可在5GATC3序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基，这样可使一些识别顺序中含有5GATC3的限制性内切酶不能切割来自大肠杆菌的DNA如Bcl I（TGATCA），但BamH I（GGATAA）则不会因为N6A的甲基化而失去活性，因为这两种酶对底物的特异性不同。 　　dcm甲基化酶 此酶在序列5CCAGG3或5CCTGG3中的胞嘧啶C5上引入甲基，受其影响的限制性内切酶是EcoR II。 　（二） 甲基化酶在基因工程中用途　　许多II类限制性内切酶，都存在着相对的甲基化酶，它们可修饰限制酶识别顺序中的第三位腺嘌呤上，封闭酶切位点，从而使其免受切割。如：M.EcoRI催化s-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）的甲基转移到EcoRI识别顺序中的第三位腺嘌呤上，从而使DNA免受EcoRI的切割。 * DNA ligase ? ? DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的。它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5-PO4与另一DNA链的3-OH生成磷酸二酯键。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外)，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。 一般性质：大肠杆菌的DNA连接酶是一条分子量为75KD的多肽链。对胰蛋白酶敏感，可被其水解。水解后形成的小片段仍具有部份活性，可以催化酶与NAD(而不是ATP)反应形成酶-AMP中间物，但不能继续将AMP转移到DNA上促进磷酸二酯键的形成。DNA连接酶在大肠杆菌细胞中约有300个分子，和DNA聚合酶Ⅰ的分子数相近，这也是比较合理的现象。因为