单克隆抗体的发展情况程序.pptVIP

? 2006 Accenture. All rights reserved. * Footnote Source: Source Subject Title Unit of Measure MASTER STAMP * Footnote Source: Source ? 2006 Accenture. All rights reserved. ? 2006 Accenture. All rights reserved. * Monoclonal antibody technology ? 2006 Accenture. All rights reserved. * 轻链（L）由约214个amino acid组成，分两种：Kappa（κ）和Lambda（λ），重链由450-550个amino acid组成，根据其抗原性差异可分为5种：μ链、γ链、α链、δ链和ε链。由此将免疫球蛋白分为M、G、A、D和E。 ? 2006 Accenture. All rights reserved. * 1 抗体技术的发展 抗体技术的发展 第一代 多克隆抗体 第二代 细胞工程抗体 第三代 基因工程抗体 单克隆抗体技术的发展 第1代单抗技术：鼠源性单克隆抗体 第2代单抗技术：嵌合性单克隆抗体 第3代单抗技术：人源化单克隆抗体 第4代单抗技术：全人源化单克隆抗体 ? 2006 Accenture. All rights reserved. * 1 细胞工程单克隆抗体 ? 2006 Accenture. All rights reserved. * 2 单链抗体（scFv） SOE法构建scFv基因产物 VH VL VL VH 变性、复性 接头DNA，（Gly4Ser）3 引物 引物 接头DNA PCR 重叠延伸拼接法（SOE），是把Linker 的编码序列分别设计在扩增VH和VL引物中，用PCR直接合成scFv基因。 scFv的优点是分子量小、免疫原性弱、渗透力强，并具有药物导向、中和毒素等功能，不需要进行糖基化修饰，可以在原核表达系统中进行表达。缺点是无抗体C区，不能介导抗体的其他生物学活性。 ? 2006 Accenture. All rights reserved. * 3 Fab抗体 Fab抗体分子的制备 Pr VH VH VL CL CH1 CH1 VL CL S-S- H链表达载体 L链表达载体 共转染细胞 抗体分泌细胞 Fab片段是由H链Fd段和完整L链通过二硫键形成的异二聚体，仅含有一个抗原结合位点，大小为完整抗体的1/3。可利用噬菌体构建表达有天然构象的Fab片段。 Fab片段有中和毒素和病毒，封闭受体和药物的螯合作用，其免疫原性低，但半衰期比完整抗体短的多。 Pr ? 2006 Accenture. All rights reserved. * 4 抗体库技术 抗体库按基因的来源可分为：鼠源性抗体库，人源性抗体库和驼源性抗体库 抗体库展示技术：噬菌体表面展示技术，酵母表面展示技术，核糖体展示技术 抗体库技术的优点： 1 不需要进行细胞融合，避免了因杂交瘤不稳定而需要反复亚克隆的繁琐程序。 2 扩大了筛选容量，可达到106以上的克隆，而杂交瘤技术一般只能筛选约1000个克隆。 3 可直接克隆到抗体的基因，便于进一步构建各种基因工程抗体。 4 得到的抗体可以进行原核表达，降低制备成本。 5 构建抗体库时由于H链和L链V区基因在体外随机组合，因而可以获得新的特异性抗体。 已有的噬菌体抗体库：抗HIV，麻疹病毒，破伤风类毒素，呼吸道合抱病毒，乙肝病毒，单纯疱疹病毒糖蛋白和TNF-α等的抗体库。 ? 2006 Accenture. All rights reserved. * 构建方法 1 动物免疫 2 血清效价检测 3 淋巴细胞的分离纯化 4 总RNA提取 5 第一链cDNA反转录合成 6 轻、重链基因的扩增 7 scFv DNA的组装与扩增 8 scFv DNA片段的Sfi I/Not I 酶切 9 pCANTAB5E –scFv 重组质粒的构建 10 重组噬菌体的制备 11 库容量的滴定 12 单链抗体噬菌体抗体库的富集淘选 4.1 噬菌体展示技术构建和筛选scFv 图片来源：苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 ? 2006 Accenture. All rights reserved. * 4.2 噬菌体展示技术构建和筛选Fab抗体 构建方法 淋巴细胞分离、总RNA提取及cDNA的合成与scFv抗体库的构建相同 1 PCR扩增Fd及轻链基因 2 PCR扩增产物的纯化 3 轻链基因的克隆 4 重链Fd基因的克隆及噬菌体抗体库的建立和鉴定 5 Fd基因的