第5章 高效液相色谱法.ppt

4-1 高效液相色谱概述 您有一个问题需要解决 分离技术 HPLC 和 GC 的比较 HPLC 和 GC 的比较 HPLC 和 GC 的比较 HPLC 和 GC 的比较 HPLC 和 GC 的比较 我们如何分析这一样品? 分离 分离 分离 分离 分离 分离 分离 分离 分离 分离 分离 分离 分离 分离 分离 分离 分离 HPLC 分析参数 HPLC的分离模式 HPLC 应用 流程及主要部件 流程 2.主要部件 梯度淋洗装置 一般流出问题 梯度洗脱 - 一个解决方案 多肽的梯度分离 梯度方法开发- 优化溶剂梯度 对下列每种情况，您认为使用哪种梯度曲线能改善分离? 改变流速 手动进样器 样品环(Loop) 规格：有10μL、20μL、50μL等不同容积， 可以根据需要选配。 作用：用来贮液，也用来测量样品溶液的体积。 将样品环装满后进样，进样量即为样品环的容积，此种进样方式称为“满环进样”或“定量环进样”。 用定量环进样精密度好，在使用外标法时，应使用此种操作方式。 工作原理：基于朗伯-比尔定律。 即用特定波长的紫外光照射样品池，通过检测透光率的变化来测定样品浓度的检测器。 它具有波长固定，波长可变和光电二极管阵列三种类型。 工作原理:通过检测光散射程度而测定溶质浓度的检测器。色谱柱后流出物在通向检测器途中，被高速载气(氮气)喷成雾状液滴，再进入蒸发漂移管中，流动相不断蒸发，含溶质的雾状液滴形成不挥发的微小颗粒，被载气载带通过检测器。在检测器中，光被散射的程度取决于溶质颗粒的大小与数量。 适用范围：适用检测挥发性低于流动相的组分，主要用于检测糖类，高级脂肪酸，磷脂， 维生素，氨基酸，甘油三酯及甾体等。 特 点：通用型检测器，对各物质有几乎相同的响应。 消除溶剂的干扰，不受温度变化影响， 　　　 灵敏度比较低（尤其对有紫外吸收的组分） 流动相必须是挥发性的，不能含有缓冲盐等。 5.3 HPLC 分离模式1. 正相 LC (NP-LC）2. 反相LC (RP-LC)3. 反相离子对LC(IP-LC) 4. 离子交换LC (IEC)5. 体积排阻色谱 (SEC) NP-LC在这一部分您将学习: 正相HPLC分离机理和应用. 正相HPLC洗脱顺序. 如何选择正相色谱柱. 如何选择正相色谱流动相. 吸附色谱 - 正相 正相 HPLC 保留顺序 分离选择性 异构体的正相色谱分离 固定相 洗脱强度 分离原理 等洗脱强度 对各类化合物的溶剂强度 减活化剂 - 用于硅胶柱 2. 反相HPLC 在这一部分您将学习: 反相色谱机理. HPLC的应用. 关于反相色谱柱上的保留. HPLC如何选择流动相. 如何选择反相色谱柱. 反相分离的定义和机理 反相 HPLC的应用 反相HPLC的保留顺序 预测流出顺序 用于HPLC的溶剂 反相HPLC中最好的有机溶剂? 溶剂强度 选择反相色谱柱 反相色谱柱 不同键合相上小肽的分离 色谱柱参数举例 孔径和分子尺寸对峰宽的影响 单体键合相和聚合键合相 残留硅醇基的处理 - 封端和立体保护相 3. 离子对RP-LC 在这一部分您将学习: 如何用离子抑制剂控制弱酸性样品的保留. 如何使弱减样品更容易分离. 如何分离弱酸、弱减和中性化合物的混合物. 如何用离子对HPLC分离强酸和强碱. 弱酸的分离 保留作用随 pH的变化 缓冲液 缓冲液浓度 缓冲液类型对色谱柱稳定性的影响 胺与硅醇基的相互作用---二次保留 弱减 - 不同 pH条件下的分离 封端色谱柱减少了二次保留作用 用密集封端柱改善分离 - 分析氨甲蝶呤的美国药典方法 分离弱离子化化合物的初始实验条件 离子对反相 HPLC 分离强酸和强碱 离子对反相HPLC分离阴离子 优化离子对 HPLC 4. 离子交换色谱（IEC） 在这一部分您将学习: 离子交换HPLC分离机理. 如何选择离子交换固定相. 流动相的pH如何影响分离结果. 什么因素影响离子交换色谱的分离. 离子色谱基础知识. 离子交换机理 离子交换HPLC的应用 - 铵和低分子量的胺 - 季胺化合物 - 卤氧化物 - 弱有机酸 - 硅酸盐 - 脂肪族和芳香族磺酸盐 - 碳水化合物 - 氨基酸 - 蛋白质 - 离子色谱能够分离和检测： 痕量离子型物质，如： F-, Br-, Cl-, NO2-, NO3-, HPO4-2, SO4-2, Li+, Na+, K+, Mg+2, Ca+2, Sr+2, Ba+2 固定相的官能团 pH对样品的影响 离子交换流动相 强阴离子交换分离蛋白质 离子色谱 -