食品酶学实验-菠萝蛋白酶.doc

食品酶学综合性实验 实验1 菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定 【目的和要求】 1. 了解酶分离纯化的一般程序； 2. 掌握硫酸铵沉淀法、透析法分离提取菠萝蛋白酶的基本原理和方法； 3. 熟悉蛋白质含量测定、菠萝蛋白酶活力测定等实验原理和方法。 【实验原理】 建立有效的酶纯化程序应考虑的原则 （1）利用酶在分离纯化上最有利的特性； （2）尽早使用一种选择性好的方法； （3）选择交换能力高的层析技术作为第一步层析； （4）不要连续使用相同的纯化方法； （5）将各层析步骤连接起来，使前一步得到的样品适用于下一步层析； （6）在造成酶被稀释的步骤后来要用浓缩酶的方法； （7）要使每步过程的分辨能力呈递增趋势； （8）每步纯化过程后，通过量体积，酶活力和蛋白质浓度测定，监测纯化的进程。 菠萝蛋白酶简介 菠萝蛋白酶（Bromelain，EC 3.4.22.3）简称菠萝酶，是从凤梨属植物菠萝中提取的一组复合的半胱氨酸巯基蛋白水解酶。在食品工业中菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂，能分解蛋白质、肽、酯和酰胺等，可用于肉质嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、干酪生产等。在医药上它可以治疗水肿及多种炎症。 1891年Mercaro于菠萝的汁中首先发现。菠萝蛋白酶属于糖蛋白，是由巯基蛋白酶和非蛋白酶组分构成的复杂复合物，因含有一个不稳定的游离巯基，所以菠萝蛋白酶极易被氧化而使其酶活下降。菠萝蛋白酶的相对分子质量大约为33 000DW，等电点 9.55，最适pH在7.1左右，在偏酸环境下酶活下降较快，碱性环境能延缓失活。菠萝蛋白酶的温度的最稳定范围是55℃~65℃。金属盐离子中NaCl、KCl对酶活的影响不是很大，维生素C、半胱氨酸、硫代硫酸钠、2-巯基乙醇是菠萝蛋白酶的稳定剂，，EDTA能通过螯合对酶活有影响的金属离子而保护菠萝蛋白酶，有机溶剂中甲醇、乙醇、乙二醇对酶活损失较大。 菠萝蛋白酶的粗分离 （1）盐析分离 盐析法是粗分离蛋白质的重要方法之一。在稀盐溶液中，蛋白质的溶解度随盐浓度的增加而升高，这种现象称为盐溶。但当盐浓度增加到一定量时，其溶解度又逐渐下降，直到某一浓度时便从溶液中沉淀出来，这种现象即为盐析。利用盐析作用可使不同蛋白质从溶液中析出从而实现分离。这是因为蛋白质是亲水胶体，在高浓度的中性盐影响下脱去水化层，同时，蛋白质分子所带的电荷被中和，结果蛋白质的胶体稳定性遭到破坏而沉淀析出。经透析或用水稀释时又可溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。盐析不同的蛋白质所需中性盐浓度与蛋白质种类及pH有关。分子量大的蛋白质（如球蛋白）比分子量小的（如白蛋白）易于析出。改变盐浓度，使得不同分子量的蛋白质分别析出。用于盐析的中性盐通常有硫酸铵、硫酸钠和硫酸镁等。由于硫酸铵的溶解度大而温度系数小（在25℃时，溶解度为767g/L；在0℃时，溶解度为697g/L），分离效果好，能保持蛋白质的天然构象，且价廉易得，以硫酸铵最为常用。不同蛋白质盐析时所需盐浓度不同，调节盐浓度可适当地将不同的蛋白质分开。如鸡蛋清中的球蛋白在50%饱和度硫酸铵溶液中沉淀，清蛋白100%饱和硫酸铵中沉淀。硫酸铵的饱和度可从附录的“硫酸铵饱和度计算表”中查找，计算所需添加的硫酸铵量。 透析和超滤 透析和超滤是利用蛋白质分子不能透过半透膜，而小分子可以自由透过的性质，使蛋白质与小分子物质分开。透析是将待提纯的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋里，扎紧袋口放在蒸馏水或缓冲溶液中进行。透析时，需不断更换透析外液，直到透析袋内小分子物质降低至内外平衡为止。超滤是利用压力或离心力，借助超滤膜将不同分子质量物质分离的技术。超滤膜是由丙烯晴、醋酸纤维、硝酸纤维、尼龙等高分子聚合物制成的多空薄膜，截留的颗粒直径为2~20nm，相当于相对分子质量1 000~5×105.超滤技术不仅使蛋白质得以分离纯化，还可以达到浓缩的目的。 菠萝蛋白酶活性测定 酪蛋白是一种蛋白质，它被菠萝蛋白酶降解生成的酪氨酸在紫外光区2nm处有最大吸收，且光吸收值与含量成正比，符合Beer定律。根据测定的2nm处的吸收值，可判定菠萝蛋白酶的酶活性。 【实验仪器和用品】 实验仪器 电子天平、恒温水浴锅、电磁搅拌器、酸度计、可见紫外分光光度计（配石英比色杯和玻璃比色杯）、冰箱、高速离心机、台式天平（离心平衡用）。 实验用品 以组为单位的用品 大试管18mm×200 mm（10支）、试管架（2个）、烧杯（50mL×1，100mL×2， 200mL×1）、滴管（2支）、玻璃棒（2支）、移液管（5mL×1，1mL×2，0.1mL×1，0.2 mL×1）、漏斗（3个）、量筒 （100mL×1）、研钵、白瓷板、纱布、滤纸、蒸馏水瓶、洗耳球、标签纸、。 （2）全班共用的用品 试剂瓶（1000mL×7，250mL×3，60mL×2